МУК 4.1.3956-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в зерне гороха, семенах и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 05.07.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 05.10.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 5 июля 2023 года
Дата введения 5 октября 2023 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЛУОКСАСТРОБИНА И ЕГО ГЕОМЕТРИЧЕСКОГО Z-ИЗОМЕРА В ЗЕРНЕ ГОРОХА, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ СОИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3956-23
1. Разработаны ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр „Агроэкология пестицидов и агрохимикатов“ Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, А.С. Поликарпов, Е.Н. Тестова).»
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой «05» июля 2023 г.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) для определения уровня остаточных количеств флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в зерне гороха, семенах и масле сои в диапазоне (0,01 — 0,1) мг/кг.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
2.1. Физико-химические свойства флуоксастробина и его геометрического Z-изомера.
Название действующего вещества по ИЮПАК: (E)-{2-[6-(2-хлорофенокси)-5-фторпиримидин-4-илокси]фенил}(5,6-дигидро-1,4,2-диоксазин-3-ил)метанон O-метилоксим.
Эмпирическая формула: C21H16ClFN4O5.
Агрегатное состояние: кристаллическое вещество.
Цвет, запах: цвет белый, со слабым нехарактерным запахом.
Давление насыщенного пара при плюс 20 °C: 6 x 10-7 МПа.
Температура плавления: плюс 103 — 108 °C.
Коэффициент распределения в системе октанол/вода (при pH 7, плюс 25 °C): Kow log P = 2,86.
Растворимость в воде (при плюс 20 °C): 0,0023 г/дм3.
Растворимость в органических растворителях (в г/дм3, при плюс 20 °C): н-гептан — 0,04; толуол — 3,7; 2-пропанол — 6,7; ксилол — 38,1; ацетон, ацетонитрил, дихлорметан, этилацетат — все более 250.
Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой и щелочной средах (ДТ50 больше 1 года).
В присутствии света в водных фотолитических условиях флуоксастробин достаточно быстро деградирует с периодом полураспада 4,1 дня.
В биологически активных почвах в аэробных условиях флуоксастробин разрушается достаточно медленно: показатель ДТ50 варьирует от нескольких дней до нескольких недель.
2.2. Флуоксастробин относится к веществам малоопасным по острой оральной (ЛД50 для крыс более 2000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД50 для крыс более 2000 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК50 для крыс (4 часа) 4998 мг/м3 воздуха). Вещество не обладает раздражающим действием на слизистую оболочку глаз кролика и сенсибилизирующими свойствами. Нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей, дафний и водорослей.
2.3. Флуоксастробин — системный синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Вещество обладает защитным и искореняющим действием. При обработке вегетирующих растений подавляет развитие возбудителей ржавчины, септориоза, мучнистой росы, ломкости стеблей и пятнистости листьев на посевах ячменя, пшеницы и других культур, а при протравливании семян зерновых колосовых культур в дозах 50 — 100 г/т защищает последние от заражения твердой и пыльной головней и фузариозной корневой гнилью.
2.4 Геометрический Z-изомер флуоксастробина.
Название вещества по ИЮПАК: (Z)-{2-[6-(2-хлорофенокси)-5-фторпиримидин-4-илокси]фенил}(5,6-дигидро-1,4,2-диоксазин-3-ил)метанон O-метилоксим.
Эмпирическая формула: C21H16ClFN4O5.
Агрегатное состояние: кристаллическое вещество.
Цвет, запах: цвет белый, со слабым нехарактерным запахом.
III. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ
3.1. Метод основан на определении флуоксастробина и его геометрического Z-изомера методом ВЭЖХ с использованием диодно-матричного детектора.
3.2. Определение флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в зерне гороха и семенах сои проводится после его экстракции из образцов ацетонитрилом, дальнейшей очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах № 1 с гидрофильным слабокислым сорбентом.
Определение флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в масле сои проводится после его экстракции из образцов водно-ацетонитрильной смесью, дальнейшей очисткой экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и очисткой вымораживанием, на колонке с флорисилом и на последовательно соединенных концентрирующих патронах № 2 со слабоосновным анионообменником с привитыми аминогруппами и № 1 с гидрофильным слабокислым сорбентом.
3.3. Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
3.4. В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
IV. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
4.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические характеристики
V. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в таблицах 2 - 4.
| Наименование средства измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Хроматограф жидкостной с диодно-матричным детектором | Внесено в Реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Весы аналитические | Наибольший предел взвешивания 110 г, дискретность 0,0001 г, класс точности специальный (I) по ГОСТ Р 53228 |
| Весы лабораторные | Наибольший предел взвешивания 400 г, предел допустимой погрешности +/- 0,5 г, класс точности средний (III) по ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные лабораторные стеклянные | Тип 2-10-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные лабораторные стеклянные | Тип 1-2-2-1, 1-2-2-2 и 1-2-2-5 по ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные лабораторные стеклянные | Тип 1-10-2, 1-25-2, 1-50-2, 1-100-2, 1-250-2, 1-500-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Наименование реактива | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Флуоксастробин, аналитический стандарт | Содержание основного вещества не менее 99,5% |
| Геометрический Z-изомер флуоксастробина, аналитический стандарт | Содержание основного вещества не менее 99,0% |
| Ацетон химически чистый | ГОСТ 2603 |
| Ацетонитрил химически чистый | Содержание основного вещества не менее 99,8% |
| Ацетонитрил для ВЭЖХ | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| Вода дистиллированная | ГОСТ Р 58144 |
| Вода для лабораторного анализа | ГОСТ Р 52501 |
| Гелий очищенный | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| н-Гексан химически чистый | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Калий марганцовокислый чистый для анализа | ГОСТ 20490 |
| Кальций хлористый чистый для анализа | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции (патрон № 1) | Заполнены гидрофильным слабокислым сорбентом (С) с размером частиц 63 — 200 мкм (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции (патрон № 2) | Заполнены гидрофильным слабокислым сорбентом с постоянной активностью с размером частиц 63 — 200 мкм с привитыми аминогруппами (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) |
| Натрий сернокислый химически чистый | ГОСТ 4166 |
| Натрий хлористый химически чистый | ГОСТ 4233 |
| Флорисил (магния силикат) для колоночной хроматографии | Содержание основного вещества не менее 99%, размер частиц 60 — 100 меш |
| Этилацетат чистый для анализа | ГОСТ 22300 |
Вспомогательные устройства, материалы
| Наименование вспомогательное оборудования, устройств, материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Алонж прямой стеклянный | Тип АО по ГОСТ 25336 |
| Аппарат для встряхивания проб | Направление колебаний — возвратно-поступательное, максимальная загрузка 10 кг, амплитуда колебаний — до 30 мм, скорость от 10 до 300 колебаний в минуту |
| Банки полипропиленовые с крышками для экстракции | Объем 250 см3 |
| Ванна ультразвуковая | Рабочая частота 50 Гц |
| Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная | ГОСТ 5556 |
| Виалы, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, для жидких проб | Объем 2 см3 |
| Виалы стеклянные с крышкой с тефлоновой прокладкой | Объем не менее 40 см3 |
| Воронки делительные | Тип ВД по ГОСТ 25336 |
| Воронки лабораторные стеклянные | Тип В по ГОСТ 25336 |
| Колбы круглодонные стеклянные | Тип К по ГОСТ 25336 |
| Колбы конические стеклянные | Тип Кн по ГОСТ 25336 |
| Колонка хроматографическая стальная | Заполнена сорбентом с привитыми неполярными группами C18; линейные размеры 150 мм x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм |
| Колонки хроматографические, стеклянные или пластиковые | Длина 150 — 250 мм, диаметр 15 мм |
| Насос мембранный вакуумный | Обеспечивающий вакуум — до 10 мбар |
| Предколонка хроматографическая стальная | Заполнена сорбентом с привитыми неполярными группами C18; линейные размеры 12,5 мм x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм |
| Стаканы лабораторные стеклянные | Тип В, номинальная вместимость (100 — 800 см3) по ГОСТ 25336 |
| Ротационный вакуумный испаритель | Снабжен ручным подъемником, с диагональным конденсатором и объемом испарительной колбы от 50 до 3000 см3, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об/мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом не менее 5 дм3 и с диапазоном температур плюс (20 — 100) °C |
| Установка для перегонки растворителей | С круглодонной колбой объемом 4000 см3 и приемной конической колбой объемом 1000 см3 |
| Фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие | Диаметр 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г |
| Фильтры мембранные для очистки растворителей | Диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм |
| Шприц инъекционный многократного применения | Объем 10 см3 по ГОСТ 22967 |
Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, а также посуды, реактивов и материалов, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам.
VI. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
VII. КВАЛИФИКАЦИЯ ОПЕРАТОРОВ
7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на газовом хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VIII. ОТБОР ПРОБ
8.1. Отбор проб производится в соответствии с правилами <1>.
<1> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79.
Пробы семян сои и зерна гороха подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света и хранят в бумажной или тканевой упаковке в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Пробы соевого масла хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 10 суток.
IX. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
9.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (15 — 30) °C, относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
X. ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЙ
10.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки проверка хроматографического поведения вещества на колонке с флорисилом, концентрирующих патронах № 1, последовательно соединенных концентрирующих патронах № 2 и № 1, установление градуировочной характеристики.
Подготовка органических растворителей.
10.1.1 Очистка ацетонитрила.
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре плюс (81,0 — 82,0) °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс (81,0 — 82,0) °C, отбрасывают.
10.1.2 Очистка ацетона.
Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/дм3. Ацетон перегоняют при температуре плюс (56,0 — 56,5) °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс (56,0 — 56,5) °C, отбрасывают.
10.1.3 Очистка гексана.
Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Гексан перегоняют при температуре плюс (68,5 — 69,0) °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс (68,5 — 69,0) °C, отбрасывают.
10.1.4 Очистка этилацетата.
Этилацетат, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем этилацетат сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Этилацетат перегоняют при температуре плюс (76,5 — 77,5) °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс (76,5 — 77,5) °C, отбрасывают.
10.1.5 Приготовление бидистиллированной воды.
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3 и кипятят в течение 6 часов.
Собирают фракции, отогнанные при температуре плюс (99,5 — 100,0) °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс (99,5 — 100,0) °C, отбрасывают.
10.2 Приготовление растворов для проведения анализа.
10.2.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ.
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил и бидистиллированную воду. Ацетонитрил и бидистиллированную воду предварительно фильтруют через мембранные фильтры для очистки растворителей.
В плоскодонную колбу объемом 1000 см3 помещают 550 см3 ацетонитрила и 450 см3 бидистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают.
При использовании градиентного режима хроматографирования компоненты подвижной фазы помещают в разные емкости.
В случае отсутствия в составе хроматографической системе автоматического дегазатора через раствор подвижной фазы пропускают газообразный гелий со скоростью 20 см3/мин в течение 5 минут, после чего его помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.
Приготовленный раствор подвижной фазы хранится при комнатной температуре не более пяти дней.
10.2.2 Приготовление рабочих растворов.
10.2.2.1. Приготовление смеси ацетонитрила с водой в соотношении 9:1 (по объему).
В мерную колбу объемом 1000 см3 помещают 900 см3 ацетонитрила, прибавляют 100 см3 бидистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают. Раствор используется при экстракции флуоксастробина и его геометрического Z-изомера из образцов масла сои. Раствор готовят непосредственно перед использованием.
10.2.2.2 Приготовление насыщенного раствора хлорида натрия.
400 г хлорида натрия переносят в стеклянную емкость объемом 1000 см3, доливают 800 см3 дистиллированной воды, помещают на 15 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 30 минут на аппарат для встряхивания проб. Получают насыщенный раствор хлорида натрия над слоем нерастворившейся соли. Приготовленный раствор хранится при комнатной температуре в темном месте (в емкости из темного стекла) в течение 12-ти месяцев.
10.2.3 Приготовление градуировочных растворов.
10.2.3.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией флуоксастробина 100,0 мкг/см3.
Взвешивают 10 мг флупирадифурона в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.
10.2.3.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией геометрического Z-изомера флуоксастробина 100,0 мкг/см3.
Взвешивают 10 мг геометрического Z-изомера флуоксастробина в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.
Стандартные растворы № 1 и № 2 используют для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочных характеристик, и хранят в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.
10.2.3.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией флуоксастробина и его геометрического Z-изомера по 10,0 мкг/см3.
В мерную колбу объемом 10 см3 помещают по 1,0 см3 стандартного раствора № 1 и № 2, доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 3 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Раствор № 3 хранят в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C в течение 30 дней.
10.2.3.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией флуоксастробина и его геометрического Z-изомера по 1,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см3 раствора и помещают в мерную колбу объемом 10 см3, доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему) и перемешивают. Стандартный раствор № 4 используют для приготовления стандартных растворов для установления градуировочных характеристик и для хроматографического исследования. Раствор № 4 хранят в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C в течение 30 дней.
10.2.3.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией флуоксастробина и его геометрического Z-изомера по 0,5 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 30 дней.
10.2.3.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией флуоксастробина и его геометрического Z-изомера по 0,2 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 2 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 30 дней.
10.2.3.7. Стандартный раствор № 7 с концентрацией флуоксастробина и его геометрического Z-изомера по 0,1 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 7 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 30 дней.
10.2.3.8 Стандартный раствор № 8 с концентрацией флуоксастробина и его геометрического Z-изомера по 0,05 мкг/см3
Из стандартного раствора № 7 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 8 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 30 дней.
10.2.3.9. Стандартные растворы флуоксастробина и его геометрического Z-изомера с концентрацией по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы зерна гороха и семян сои.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом из стандартного раствора № 3 готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 флуоксастробина и его геометрического Z-изомера и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы зерна гороха и семян сои. Стандартные растворы для внесения хранятся при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 30 дней.
10.2.3.10. Стандартные растворы флуоксастробина и его геометрического Z-изомера с концентрацией по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы масла
Методом последовательного разведения ацетоном из стандартного раствора № 3 готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 флуоксастробина и его геометрического Z-изомера и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы масла. Стандартные растворы для внесения хранятся при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 30 дней.
10.3. Установление и контроль стабильности градуировочной характеристики.
10.3.1 Установление градуировочной характеристики.
Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади (высоты) пика от концентрации флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 и 0,05 мкг/см3.
В инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3. Осуществляют не менее 5-ти параллельных измерений.
10.3.2 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 1,0 мкг/см3.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
A = \frac{(X - C) \times 100}{C} \leq 10 , (1)
где X — концентрация флуоксастробина или его геометрического Z-изомера контрольного измерения, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему), взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
10 — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флуоксастробина и его геометрического Z-изомера, предусмотренных методикой выполнения измерений. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 10.3.1.
10.4. Подготовка концентрирующих патронов № 1 (с гидрофильным слабокислым сорбентом) для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения флуоксастробина и его геометрического Z-изомера на них
10.4.1 Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 см3 этилацетата, а затем 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 8:2. Элюаты отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
10.4.2. Проверка хроматографического поведения флуоксастробина и его геометрического Z-изомера на концентрирующих патронах № 1.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в ацетонитриле с концентрацией каждого вещества по 1 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 этилацетата, обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 гексана, перемешивают и вносят раствор на подготовленный патрон. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу последовательно обмывают двумя порциями по 5 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 6:4 и вносят растворы на патрон. Элюат собирают в чистые отгонные колбы объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм3 хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие флуоксастробин и его геометрический Z-изомер, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения флуоксастробина и его геометрического Z-изомера на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
10.5. Подготовка колонки с 5 г флорисила для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения флуоксастробина и его геометрического Z-изомера на ней.
10.5.1 Подготовка колонки с 5 г флорисила для очистки экстракта
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 5 г флорисила с зернением 60/100 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой флорисила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см.
В день использования колонку последовательно промывают 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 8:2 и 20 см3 гексана. Элюаты отбрасывают.
10.5.2. Проверка хроматографического поведения флуоксастробина и его геометрического Z-изомера на колонке с 5 г флорисила.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в ацетонитриле с концентрацией каждого вещества по 1 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 этилацетата, обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 гексана, перемешивают и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Колонку последовательно промывают 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1,15 см3 гексана и тремя порциями по 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1. Каждую порцию собирают отдельно в чистые отгонные колбы объемом по 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм3 хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие флуоксастробин и его геометрический Z-изомер, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.
Изучение поведения флуоксастробина и его геометрического Z-изомера колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии флорисила.
10.6. Подготовка последовательно соединенных концентрирующих патронов № 2 (со слабоосновным анионообменником с привитыми аминогруппами) и № 1 (с гидрофильным слабокислым сорбентом) для очистки экстрактов соевого масла и проверка хроматографического поведения флуоксастробина и его геометрического Z-изомера на них.
10.6.1. Подготовка последовательно соединенных концентрирующих патронов № 2 и № 1 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Соединить последовательно концентрирующие патроны № 2 (вверху) и № 1 (внизу).
Последовательно соединенные патроны устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: соединенные концентрирующие патроны промывают 10 см3 этилацетата, а затем 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1. Элюаты отбрасывают.
Не допускать высыхания поверхности патрона.
10.6.2. Проверка хроматографического поведения флуоксастробина и его геометрического Z-изомера на последовательно соединенных концентрирующих патронах № 2 и № 1
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в ацетонитриле с концентрацией каждого вещества по 1 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 этилацетата, обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 гексана, перемешивают и вносят раствор на подготовленные патроны. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C.
Исходную колбу последовательно обмывают двумя порциями по 5 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1 и вносят растворы на патрон. Элюаты собирают в чистые отгонные колбы объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм3 хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие флуоксастробин и его геометрический Z-изомер, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения флуоксастробина и его геометрического Z-изомера на последовательно соединенных концентрирующих патронах № 2 и № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
10.7. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.
Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют ее при температуре плюс 30 °C в течение 3 — 4 часов, промывая подвижной фазой (смесь ацетонитрила с бидистиллированной водой в соотношении 550:450, приготовленная по п. 10.2.1.1) при скорости подачи растворителя 1,0 см3/мин.
XI. ПРОВЕДЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ
11.1 Зерно гороха и семена сои.
11.1.1. Экстракция и очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Образец измельченной матрицы массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 50 см3 ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в делительную воронку объемом 250 см3. Экстракцию повторяют еще два раза в тех же условиях, используя каждый раз по 50 см3 ацетонитрила. Экстракты фильтруют, объединяют в делительной воронке объемом 250 см3.
К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 50 см3 гексана и встряхивают делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой возвращают в делительную воронку и повторяют процедуру еще один раз, используя 50 см3 гексана. Верхний гексановый слой отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой собирают в отгонную колбу объемом 250 см3, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, а затем упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.2 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
Сухой остаток, полученный по п. 10.1.1, растворяют в 1 см3 этилацетата, обмывают стенки колбы, добавляют 9 мл гексана, перемешивают и вносят раствор на подготовленный по п. 10.4.1 патрон № 1. Элюат отбрасывают.
Флуоксастробин и его геометрический Z-изомер элюируют с патрона 5 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 6:4, элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.2 Масло сои.
11.2.1. Экстракция, очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и очистка экстракта вымораживанием.
Образец соевого масла массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 100 см3 смеси ацетонитрила с дистиллированной водой в соотношении 9:1 (по объему), приготовленной по п. 10.2.2.1, и помещают на 30 минут на аппарат для встряхивания проб. По прошествии времени экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 см3, нижний водно-масляный слой отбрасывают.
К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 50 см3 гексана и 15 см3 насыщенного раствора хлорида натрия (приготовленного по п. 10.2.2.2), встряхивают делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой отбрасывают, средний (ацетонитрильный) слой собирают, а верхний слой (гексан) отбрасывают. Ацетонитрильный слой возвращают в делительную воронку и повторяют процедуру очистки еще один раз, используя 50 см3 гексана. Верхний гексановый слой отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой собирают в коническую колбу объемом 250 см3, пропуская его через слой безводного сульфата натрия.
Ацетонитрильный экстракт помещают в морозильную камеру и выдерживают в течение 30 минут при температуре не выше минус 18 °C. После вымораживания ацетонитрильный экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см3 и выпаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.
11.2.2 Очистка экстракта на колонке с флорисилом.
Сухой остаток, полученный по п. 10.2.1., растворяют в 1 см3 этилацетата, обмывают стенки колбы, добавляют 9 мл гексана, перемешивают и вносят раствор на подготовленную по п. 10.5.1 колонку с флорисилом. Элюат отбрасывают.
Колонку последовательно промывают 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1 и 15 см3 гексана, элюаты отбрасывают. Колонку отжимают.
Флуоксастробин и его геометрический Z-изомер элюируют с колонки 20 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.2.3. Очистка экстракта на последовательно соединенных концентрирующих патронах № 2 и № 1.
Сухой остаток, полученный по п. 11.2.2., растворяют в 1 см3 этилацетата, обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 гексана, перемешивают и вносят раствор на последовательно соединенные патроны № 1 и № 2, подготовленные по п. 10.5.1. Элюат отбрасывают.
Флуоксастробин и его геометрический Z-изомер элюируют с патрона 5 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.3 Условия хроматографирования.
11.3.1 Хроматографическая система, включающая:
- хроматограф жидкостной с диодно-матричным детектором, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от плюс 15 до плюс 80 °C и с возможностью использования стандартного автосамплера с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм3 для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;
- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.
Колонка хроматографическая стальная, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Предколонка хроматографическая стальная, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Температура колонки: плюс 30 °C.
Подвижная фаза: смесь ацетонитрила с бидистиллированной водой в соотношении 550:450 (по объему) при хроматографировании в изократическом режиме.
Скорость потока элюента: 1,0 см3/мин.
Чувствительность не менее 8 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.
Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор флуоксастробина и его геометрического Z-изомера с концентрацией 1 мкг/см3, соответственно разбавляют. В этом случае разбавление учитывают в конечной формуле расчета содержания флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в пробах.
XII. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ
12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в пробах рассчитывают по формуле, без учета полноты извлечения вещества из проб:
где X — содержание флуоксастробина или его геометрического Z-изомера в пробе, мг/кг;
A — концентрация флуоксастробина или его геометрического Z-изомера, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см3;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г.
XIII. ПРОВЕРКА ПРИЕМЛЕМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ ПАРАЛЛЕЛЬНЫХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ
13.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , (4)
где X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (таблица 1), при этом r = 2,8 \times \sigma_{r} .
При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XIV. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
14.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг при вероятности P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\Delta = \delta \cdot \overline{X}100 ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«- содержание флуоксастробина и его геометрического Z-изомера в зерне гороха, семенах и масле сои — менее 0,01 мг/кг».
XV. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
15.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6).
Периодичность и формы контроля определяется руководством по качеству.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ФЛУОКСАСТРОБИНА И ЕГО ГЕОМЕТРИЧЕСКОГО Z-ИЗОМЕРА ИЗ ЗЕРНА ГОРОХА, СЕМЯН И МАСЛА СОИ (5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, P = 0,95)
Библиографические ссылки
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. ГОСТ Р 8.563 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений».
3. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6) «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
4. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
5. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
6. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
7. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
8. ГОСТ 12.4.009 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
9. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
10. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
11. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
12. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
13. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
14. ГОСТ Р 58144 «Вода дистиллированная. Технические условия».
15. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
16. ГОСТ 5556 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».
17. ГОСТ 22967 «Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний».
18. ГОСТ 2603 «Реактивы. Ацетон. Технические условия»
19. ГОСТ 20490 «Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия».
20. ГОСТ 4166 «Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия».
21. ГОСТ 4233 «Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».
22. ГОСТ 22300 «Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия».
23. ГОСТ 13586.3 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб».
24. ГОСТ 10852 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».
25. ГОСТ 17109 «Соя. Требования при заготовках и поставках».
26. ГОСТ 31760 «Масло соевое. Технические условия».
27. ГОСТ 32190 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб».