МУК 4.1.3954-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств люфенурона в плодах и соке персика, зерне гороха и нута, семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 05.07.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 05.10.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 5 июля 2023 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЮФЕНУРОНА В ПЛОДАХ И СОКЕ ПЕРСИКА, ЗЕРНЕ ГОРОХА И НУТА, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3954-23
Дата введения 5 октября 2023 года
1. Разработаны ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр „Агроэкология пестицидов и агрохимикатов“ Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, А.С. Поликарпов, Е.Н. Тестова).»
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 5 июля 2023 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) для определения уровня остаточных количеств люфенурона в плодах и соке персика в диапазоне 0,1 — 1,0 мг/кг, в зерне гороха и нута, в семенах и масле подсолнечника в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические свойства
2.1 Физико-химические свойства люфенурона.
Название действующего вещества по ИЮПАК: 1-/2,5-дихлор-4-(1,1,2,3,3,3-гексафтор-пропокси)-фенил-3-(2,6-дифтор-бензоил)-мочевина.
Эмпирическая формула: C17H8Cl2F8N2O3.
Агрегатное состояние: белое или бесцветное кристаллическое вещество.
Цвет, запах: белый или бесцветный, без запаха.
Давление насыщенного пара (при плюс 20 °C): 4,0 x 106 Па.
Температура плавления: плюс 168,7 — 169,4 °C.
Коэффициент распределения в системе октанол/вода: KowlogP = 5,12.
Растворимость в воде: 0,046 мг/дм3 (при плюс 20 °C).
Растворимость в органических растворителях (г/дм3 при плюс 20 °C): ацетон — 460; этилацетат — 330; толуол — 72; этанол — 41; гексан — 0,13.
Вещество стабильно на воздухе и на свету, медленно гидролизуется в водных растворах при pH 5 — 9: DT50 = 160 дней (pH 5), 70 дней (pH 7) и 32 дня (pH 9).
В биологически активных почвах в аэробных условиях люфенурон быстро разлагается: DT50 = 13 — 20 дней.
2.2. Люфенурон относится к малоопасным веществам по острой оральной токсичности (ЛД50 для крыс и мышей более 2000 мг/кг) и по дермальной токсичности (ЛД50 для крыс более 2000 мг/кг), но к умеренно опасным по ингаляционной токсичности (ЛК50 для крыс (4 часа) более 2350 мг/м3 воздуха). Люфенурон не оказывает раздражающего воздействия на кожу и слизистую оболочку глаз кроликов. Нетоксичен для диких животных, птиц, пчел, земляных червей, почвенных микроорганизмов и токсичен для дафний.
2.3. Инсектоакарицид из группы ингибиторов синтеза хитина, эффективно уничтожает листогрызущие личинки чешуекрылых и жесткокрылых, эриофиидных клещей на хлопчатнике, сое, овощных культурах, винограде, семечковых плодовых, картофеле и кукурузе в течение вегетационного периода.
III. Метод измерения
3.1. Метод основан на определении люфенурона методом ВЭЖХ с использованием диодно-матричного детектора.
3.2. Определение люфенурона в зерне гороха проводится после его экстракции из образцов ацетонитрилом, дальнейшей очистки экстракта на колонке с силикагелем и на концентрирующих патронах № 1.
Определение люфенурона в зерне нута проводится после его экстракции из образцов ацетонитрилом, дальнейшей очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, очистки на колонке с силикагелем и на концентрирующих патронах № 1.
Определение люфенурона в семенах подсолнечника проводится после его экстракции из образцов ацетонитрилом, дальнейшей очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, очистки на колонках с флорисилом и силикагелем, а также на концентрирующих патронах № 1.
Определение люфенурона в масле подсолнечника проводится после его экстракции из образцов гексаном, дальнейшей очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, очистки на колонках с флорисилом и силикагелем, а также на концентрирующих патронах № 1.
Определение люфенурона в плодах персика проводится после его экстракции из образцов ацетонитрилом, дальнейшей очистки экстракта гексаном методом перераспределения между несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.
Определение люфенурона в соке из плодов персика проводится после его экстракции из образцов ацетонитрилом, дальнейшей очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, очистки на колонке с силикагелем и на концентрирующих патронах № 1.
3.3. Идентификация вещества проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
3.4. В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
IV. Метрологические характеристики
4.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 4.1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические характеристики
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Хроматограф жидкостный с диодно-матричным детектором | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Весы аналитические | Наибольший предел взвешивания 110 г, дискретность 0,0001 г, класс точности специальный (I) по ГОСТ Р 53228 |
| Весы лабораторные | Наибольший предел взвешивания 400 г, предел допустимой погрешности +/- 0,5 г, класс точности средний (III) по ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные лабораторные стеклянные | Тип 2-10-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные лабораторные стеклянные | Тип 1-2-2-1, 1-2-2-2 и 1-2-2-5 по ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные лабораторные стеклянные | Тип 1-10-2, 1-25-2, 1-50-2, 1-100-2, 1-250-2, 1-500-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Люфенурон, аналитический стандарт | Содержание основного вещества не менее 99,5% |
| Ацетонитрил, химически чистый | Содержание основного вещества не менее 99,8% |
| Ацетонитрил для ВЭЖХ | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| Вода дистиллированная | ГОСТ Р 58144 |
| Вода для лабораторного анализа | ГОСТ Р 52501 |
| Гелий очищенный | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| н-Гексан, химически чистый | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Кальций хлористый, чистый для анализа | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Калий марганцовокислый, чистый для анализа | ГОСТ 20490 |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции (патрон № 1) | Заполнены гидрофильным слабокислым сорбентом (C) с размером частиц 63 — 200 мкм (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) |
| Натрий сернокислый, химически чистый | ГОСТ 4166 |
| Натрий хлористый, химически чистый | ГОСТ 4233 |
| Силикагель, высокой чистоты | Для колоночной хроматографии, размер частиц 100 — 200 меш |
| Флорисил (магния силикат) для колоночной хроматографии | Содержание основного вещества не менее 99%, размер частиц 60 — 100 меш |
| Этилацетат, чистый для анализа | ГОСТ 22300 |
Вспомогательные устройства, материалы
| Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Аллонж прямой стеклянный | Тип АО по ГОСТ 25336 |
| Аппарат для встряхивания проб | Направление колебаний — возвратно-поступательное, максимальная загрузка 10 кг, амплитуда колебаний — до 30 мм, скорость от 10 до 300 колебаний в минуту |
| Банки полипропиленовые с крышками для экстракции | Объем 250 см3 |
| Ванна ультразвуковая | Рабочая частота 50 Гц |
| Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная | ГОСТ 5556 |
| Виалы, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, для жидких проб | Объем 2 см3 |
| Виалы стеклянные с крышкой с тефлоновой прокладкой | Объем не менее 40 см3 |
| Воронки делительные | Тип ВД по ГОСТ 25336 |
| Воронки лабораторные стеклянные | Тип В по ГОСТ 25336 |
| Колбы круглодонные стеклянные | Тип К по ГОСТ 25336 |
| Колбы конические стеклянные | Тип Кн по ГОСТ 25336 |
| Колонка хроматографическая стальная | Заполнена сорбентом с привитыми полярными группами C18; линейные размеры 150 мм x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм |
| Колонки хроматографические, стеклянные или пластиковые | Длина 150 — 250 мм, диаметр 15 мм |
| Насос мембранный вакуумный | Обеспечивающий вакуум до 10 мбар |
| Предколонка хроматографическая стальная | Заполнена сорбентом с привитыми полярными группами C18; линейные размеры 12,5 мм x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм |
| Ротационный вакуумный испаритель | Снабжен ручным подъемником, с диагональным конденсором и объемом испарительной колбы от 50 до 3000 см3, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об/мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом не менее 5 дм3 и с диапазоном температур плюс 20 — 100 °C |
| Стаканы лабораторные стеклянные объемом | Тип B, номинальная вместимость 100 — 800 см3 по ГОСТ 25336 |
| Установка для перегонки растворителей | С круглодонной колбой объемом 4000 см3 и приемной конической колбой объемом 1000 см3 |
| Фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие | Диаметр 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г |
| Фильтры мембранные для очистки растворителей | Диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм |
| Шприц инъекционный многократного применения | Объем 10 см3 по ГОСТ 22967 |
Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, а также посуды, реактивов и материалов, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
VII. Квалификация операторов
7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на газовом хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VIII. Отбор проб
8.1. Отбор проб производится в соответствии с правилами <1>.
<1> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79.
Пробы плодов персика хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C до 2 лет.
Пробы зерна гороха и нута, а также семян подсолнечника подсушивают при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света и хранят в бумажной или тканевой упаковке в сухом хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Пробы персикового сока и подсолнечного масла хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 7 суток.
IX. Условия проведения измерений
9.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 — 30 °C, относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
X. Подготовка к определению
10.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, проверка хроматографического поведения вещества на колонке с силикагелем и концентрирующих патронах № 1, установление градуировочной характеристики.
Подготовка органических растворителей.
10.1.1 Очистка ацетонитрила.
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3.
Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре плюс 81,0 — 82,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 81,0 — 82,0 °C, отбрасывают.
10.1.2 Очистка гексана.
Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Гексан перегоняют при температуре плюс 68,5 — 69,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 68,5 — 69,0 °C, отбрасывают.
10.1.3 Очистка этилацетата.
Этилацетат, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем этилацетат сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Этилацетат перегоняют при температуре плюс 76,5 — 77,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 76,5 — 77,5 °C, отбрасывают.
10.1.4 Приготовление бидистиллированной воды.
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3 и кипятят в течение 6 часов.
Собирают фракции, отогнанные при температуре плюс 99,5 — 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 99,5 — 100,0 °C, отбрасывают.
10.2 Приготовление растворов для проведения анализа.
10.2.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ.
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил и бидистиллированную воду. Ацетонитрил и бидистиллированную воду предварительно фильтруют через мембранные фильтры для очистки растворителей.
В плоскодонную колбу объемом 1000 см3 помещают 300 см3 бидистиллированной воды и 700 см3 ацетонитрила. Смесь тщательно перемешивают.
При использовании градиентного режима хроматографирования компоненты подвижной фазы помещают в разные емкости.
В случае отсутствия в составе хроматографической системы автоматического дегазатора через раствор подвижной фазы пропускают газообразный гелий со скоростью 20 см3/мин в течение 5 минут, после чего его помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.
Приготовленный раствор подвижной фазы хранится при комнатной температуре не более пяти дней.
10.2.2 Приготовление градуировочных растворов.
10.2.2.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией люфенурона 100,0 мкг/см3.
Взвешивают 10 мг люфенурона в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 3 месяцев.
10.2.2.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией люфенурона 10,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики и для внесения в контрольные образцы матриц. Стандартный раствор № 2 хранится в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 3 месяцев.
10.2.2.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией люфенурона 1,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 (по объему). Стандартный раствор № 3 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.
10.2.2.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией люфенурона 0,5 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 (по объему). Стандартный раствор № 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.
10.2.2.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией люфенурона 0,2 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 2 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 (по объему). Стандартный раствор № 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.
10.2.2.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией люфенурона 0,1 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 (по объему). Стандартный раствор № 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.
10.2.2.7. Стандартный раствор № 7 с концентрацией люфенурона 0,05 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 6 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 (по объему). Стандартный раствор № 7 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.
10.2.2.8. Стандартные растворы люфенурона с концентрациями 10,0; 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы матриц.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом из стандартного раствора № 1 готовят растворы, содержащие по 10,0; 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 люфенурона, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы матриц. Стандартные растворы для внесения хранятся при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.
10.2.2.9. Стандартные растворы люфенурона с концентрациями 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы масла.
Методом последовательного разведения ацетоном из стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 люфенурона, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы масла. Стандартные растворы для внесения хранятся при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 1 месяца.
10.3. Установление и контроль стабильности градуировочной характеристики.
10.3.1 Установление градуировочной характеристики.
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации люфенурона в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 и 0,05 мкг/см3.
В инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 11.7. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
10.3.2 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание люфенурона в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 1,0 мкг/см3.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
A = \frac{(X - C) \times 100}{C} \leq 10,
где X — концентрация люфенурона контрольного измерения, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора люфенурона в смеси ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 (по объему), взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
10 — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов люфенурона, предусмотренных методикой выполнения измерений. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 10.3.1.
10.4. Подготовка концентрирующих патронов № 1 с гидрофильным слабокислым сорбентом (C) для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения люфенурона на них.
10.4.1 Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 1 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 8:2, затем 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 95:5. Элюаты отбрасывают.
10.4.2. Проверка хроматографического поведения люфенурона на концентрирующих патронах № 1.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора люфенурона в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 5 см3 в смеси гексана с этилацетатом в соотношении 95:5, обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленный патрон. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу последовательно обмывают 5 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 95:5 и двумя порциями по 5 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 8:2 и вносят растворы на патрон. Элюаты собирают в чистые отгонные колбы объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 и хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие люфенурон, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения люфенурона на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
10.5. Подготовка колонки с 3 г силикагеля для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения люфенурона на ней.
10.5.1 Подготовка колонки с 3 г силикагеля для очистки экстракта.
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г силикагеля и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента.
Колонку с силикагелем устанавливают на аллонж с отводом для вакуума.
Кондиционирование: колонку промывают 10 см3 гексана, затем 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1. Элюаты отбрасывают.
10.5.2. Проверка хроматографического поведения люфенурона на колонке с 3 г силикагеля.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора люфенурона в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 этилацетата, обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 гексана, перемешивают и вносят раствор на подготовленную колонку. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу последовательно обмывают пятью порциями по 5 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 8:2 и вносят раствор на колонку. Элюаты собирают в чистые отгонные колбы объемом по 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 и хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие люфенурон, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.
Изучение поведения люфенурона на колонках с силикагелем проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии силикагеля.
10.6. Подготовка колонки с 5 г флорисила для очистки экстрактов семян и масла подсолнечника и проверка хроматографического поведения люфенурона на ней.
10.6.1 Подготовка колонки с 5 г флорисила для очистки экстракта.
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 5 г флорисила с зернением 60/100 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой флорисила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см3.
В день использования колонку последовательно промывают 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1 и 15 см3 гексана, элюаты отбрасывают.
10.6.2. Проверка хроматографического поведения люфенурона на колонке с 5 г флорисила.
В экстракт контрольного образца семян или масла подсолнечника, приготовленных по п. 10.3.1 или 10.4.1 соответственно, вносят 1 см3 стандартного раствора люфенурона в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Маслянистый остаток растворяют в 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1, обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленную колонку. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу последовательно обмывают 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1, 15 см3 гексана и пятью порциями по 5 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1 и вносят растворы на колонку. Элюаты собирают в чистые отгонные колбы объемом по 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 и хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие люфенурон, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.
Изучение поведения люфенурона на колонках с флорисилом проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии силикагеля.
10.7. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.
Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют ее при температуре плюс 30 °C в течение 3 — 4 часов, промывая подвижной фазой, приготовленной по п. 10.2.1, при скорости подачи растворителя 0,8 см3/мин.
XI. Проведение измерений
11.1 Зерно гороха.
11.1.1 Экстракция.
Образец измельченного зерна гороха массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 50 см3 ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см3. Экстракцию повторяют еще два раза в тех же условиях, каждый раз используя по 50 см3 ацетонитрила. Экстракты фильтруют, объединяют в отгонной колбе объемом 250 см3 и выпаривают до сухого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.2 Очистка экстракта на колонке с 3 г силикагеля.
Сухой остаток, полученный по п. 11.1.1, растворяют в 1 см3 этилацетата, обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 гексана и вносят раствор на подготовленную по п. 10.5.1 колонку, элюат отбрасывают.
Люфенурон элюируют с колонки 20 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 8:2, собирая элюат в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.3 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
Сухой остаток, полученный по п. 11.1.2, растворяют в 5 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 95:5, обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленный по п. 10.4.1 патрон, элюат отбрасывают.
Исходную колбу обмывают 5 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 95:5, элюат отбрасывают.
Люфенурон элюируют с патрона 5 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 8:2, собирая элюат в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.2 Зерно нута.
11.2.1. Экстракция и очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Образец измельченного зерна нута массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 50 см3 ацетонитрила и помещают на 10 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в делительную воронку на 250 см3. Экстракцию повторяют еще два раза в тех же условиях, каждый раз используя по 50 см3 ацетонитрила. Экстракты фильтруют, объединяют в делительной воронке на 250 см3.
К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 50 см3 гексана и встряхивают делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой возвращают в делительную воронку и повторяют процедуру очистки еще один раз, используя 50 см3 гексана. Верхний гексановый слой отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой собирают в отгонную колбу объемом 250 см3, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку по п. 11.1.2. Очистка экстракта на колонке с 3 г силикагеля и по п. 11.1.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.3 Семена подсолнечника.
11.3.1. Экстракция и очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Образец измельченных семян подсолнечника массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 50 см3 ацетонитрила и помещают на 10 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в делительную воронку на 250 см3. Экстракцию повторяют еще два раза в тех же условиях, каждый раз используя по 50 см3 ацетонитрила. Экстракты фильтруют, объединяют в делительной воронке на 250 см3.
К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 50 см3 гексана и встряхивают делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой возвращают в делительную воронку и повторяют процедуру очистки еще один раз, используя 50 см3 гексана. Верхний гексановый слой отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой собирают в отгонную колбу объемом 250 см3, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.
11.3.2 Очистка экстракта на колонке с 5 г флорисила.
Сухой остаток, полученный по п. 11.3.1, растворяют в 10 см3 смеси этилацетата и гексана в соотношении 9:1, обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленную по п. 10.6.1 колонку, элюат отбрасывают.
Колонку последовательно промывают 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1 и 15 см3 гексана, элюаты отбрасывают.
Люфенурон элюируют с колонки 20 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку по п. 11.1.2. Очистка экстракта на колонке с 3 г силикагеля и по п. 10.1.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.4 Масло подсолнечника.
11.4.1. Экстракция и очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Навеску подсолнечного масла массой 10 г помещают в химический стакан объемом 50 см3. Переносят ее в делительную воронку объемом 250 см3 двумя порциями гексана объемом по 50 см3. Люфенурон экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 см3, каждый раз встряхивая делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний гексановый слой отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой собирают в отгонную колбу объемом 250 см3, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку по п. 11.3.2. Очистка экстракта на колонке с 5 г флорисила по п. 11.1.2. Очистка экстракта на колонке с 3 г силикагеля по п. 11.1.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.5 Плоды персика.
11.5.1. Экстракция и очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Образец измельченных плодов персика массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 50 см3 ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в коническую колбу объемом 250 см3 с 5 г хлористого натрия. Экстракцию повторяют еще два раза в тех же условиях, каждый раз используя по 50 см3 ацетонитрила. Экстракты фильтруют, объединяют в конической колбе объемом 250 см3 с 5 г хлористого натрия, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 10 минут. Экстракт из колбы переносят в делительную воронку объемом 250 см3 (нерастворившуюся соль оставляют в колбе), оставляют до полного разделения слоев и нижний (водный) слой отбрасывают.
К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 30 см3 гексана и встряхивают делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой собирают в отгонную колбу объемом 250 см3, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку по п. 11.1.2. Очистка экстракта на колонке с 3 г силикагеля.
Сухой остаток растворяют в 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.6 Персиковый сок.
11.6.1. Экстракция и очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Навеску персикового сока массой 10 г помещают в химический стакан объемом 50 см3. Переносят ее в делительную воронку объемом 250 см3 двумя порциями ацетонитрила объемом по 50 см3.
К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 30 см3 гексана и встряхивают делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой возвращают в делительную воронку и повторяют процедуру еще один раз, используя 30 см3 гексана. Верхний гексановый слой отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой собирают в отгонную колбу объемом 250 см3, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку по п. 11.1.2. Очистка экстракта на колонке с 3 г силикагеля.
Сухой остаток растворяют в 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 7:3 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.7 Условия хроматографирования.
11.7.1 Хроматографическая система.
Колонка хроматографическая стальная, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Предколонка хроматографическая стальная, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Температура колонки: плюс 30 °C.
Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и бидистиллированной воды в соотношении 700:300 (по объему) при хроматографировании в изократическом режиме.
Скорость потока элюента: 0,8 см3/мин.
Чувствительность не менее 10 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 0,05 — 1,00 нг.
Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор люфенурона с концентрацией 1,0 мкг/см3, соответственно разбавляют. В этом случае разбавление учитывают в конечной формуле расчета содержания люфенурона в пробах.
XII. Обработка результатов измерения
12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание люфенурона в пробах рассчитывают по формуле, без учета полноты извлечения вещества из проб:
где X — содержание люфенурона в пробе, мг/кг;
A — концентрация люфенурона, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см3;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г.
XIII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
13.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |\text{Х}_{1} - \text{Х}_{2}| \cdot 100}{(\text{Х}_{1} + \text{Х}_{2})} \leq r,
где X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (табл. 4.1), при этом r = 2,8 \times \sigma_{r} .
При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XIV. Оформление результатов
14.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta),\text{мг}/\text{кг}, при вероятности P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \delta \cdot \overline{X}/100,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«Содержание люфенурона в зерне гороха и нута, семенах и масле подсолнечника — менее 0,01 мг/кг.»
Содержание люфенурона в плодах и соке персика — менее 0,10 мг/кг».
XV. Контроль качества результатов измерений
15.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляются в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6.
Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЛЮФЕНУРОНА ИЗ ПЛОДОВ И СОКА ПЕРСИКА, ЗЕРНА ГОРОХА И НУТА, СЕМЯН И МАСЛА ПОДСОЛНЕЧНИКА
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. ГОСТ Р 8.563 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений».
3. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6) «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
4. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
5. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
6. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
7. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
8. ГОСТ 12.4.009 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
9. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
10. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
11. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
12. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
13. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
14. ГОСТ Р 58144 «Вода дистиллированная. Технические условия».
15. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
16. ГОСТ 5556 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».
17. ГОСТ 22967 «Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний».
18. ГОСТ 20490 «Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия».
19. ГОСТ 4166 «Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия».
20. ГОСТ 4233 «Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».
21. ГОСТ 22300 «Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия».
22. ГОСТ 13586.3 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб».
23. ГОСТ 10852 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».
24. ГОСТ 32190 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб».
25. ГОСТ 32101 «Консервы. Продукция соковая. Соки фруктовые прямого отжима. Общие технические условия».
26. ГОСТ 22391 «Подсолнечник. Технические условия».
27. ГОСТ 1129 «Масло подсолнечное. Технические условия».
28. ГОСТ 34340 «Персики и нектарины свежие. Технические условия».