МУК 4.1.3953-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ипконазола в зерне кукурузы, семенах масличных культур (сои, подсолнечника) и в растительных маслах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 05.07.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 05.10.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 5 июля 2023 года
Дата введения 5 октября 2023 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИПКОНАЗОЛА В ЗЕРНЕ КУКУРУЗЫ, СЕМЕНАХ МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР (СОИ, ПОДСОЛНЕЧНИКА) И В РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЛАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3953-23
1. Разработаны ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр „Агроэкология пестицидов и агрохимикатов“ Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, Ю.Н. Савушкин, Е.Н. Тестова).»
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 05 июля 2023 г.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) для определения уровня остаточных количеств ипконазола в зерне кукурузы, семенах масличных культур (сои, подсолнечника) и в растительных маслах в диапазоне (0,01 — 0,10) мг/кг.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
2.1 Физико-химические свойства ипконазола.
Название действующего вещества по ИЮПАК: (1RS, 2SR, 5RS; 1RS, 2SR, 5SR)-2-(4-хлорбензил)-5-изопропил-1-(1H-1,2,4-триазол-1-илметил)-цикло-пентанол.
Эмпирическая формула: C18H24ClN3O.
Технический продукт состоит из смеси рацематов I (1RS, 2SR, 5RS) и II (1RS, 2SR, 5SR) с температурой плавления плюс 88 — 90 °C. Давление пара I — 3,58 x 10-3 мПа (плюс 25 °C), давление пара II — 6,99 x 10-3 мПа (плюс 25 °C).
Константа диссоциации (pKa, при плюс 25 °C) — -5,43.
Растворимость в воде: 6,93 мг/дм3 (при плюс 20 °C).
Не подвергается термическому разложению и гидролизу.
Коэффициент распределения в системе октанол/вода (при плюс 25 °C): Kow logP = 4,21.
2.2. Краткая токсикологическая характеристика: ипконазол относится к малоопасным по острой оральной (ЛД50 для крыс 1338 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД50 для крыс более 2000 мг/кг). СК50 (48 ч) для карпа 2,5 мг/дм3. Не раздражает кожу, слабо раздражает слизистую глаз кроликов.
2.3. Ипконазол — фунгицид для борьбы с широким кругом болезней семян, эффективен против гельминтоспориозной пятнистости листьев и ржавчины. Рацематы I и II обладают одинаковой активностью. Механизм действия — ингибирование биосинтеза эргостерина.
III. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ
3.1. Метод основан на определении ипконазола с помощью ВЭЖХ с использованием диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах № 1, № 2 и колонках с флорисилом.
Идентификация вещества проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
IV. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
4.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические характеристики
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для ипконазола
V. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
5.1 Средства измерений:
- весы аналитические класса точности по ГОСТ Р 53228 — специальный (I), с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г;
- весы лабораторные общего назначения класса точности по ГОСТ Р 53228 — средний (III) с наибольшим пределом взвешивания до 400 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,5 г;
- колбы мерные на 10, 100 и 1000 см3, ГОСТ 1770;
- пипетки мерные на 1,0; 2,0 и 5,0 см3, ГОСТ 29227;
- цилиндры мерные на 10, 25, 50, 100, 500 и 1000 см3, ГОСТ 1770;
- хроматографическая система, включающая:
- хроматограф жидкостный с диодно-матричным детектором, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °C и с возможностью использования стандартного автосамплера с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм3 для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;
- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.
5.2 Реактивы:
- ипконазол, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 98,72%;
- ацетон, химически чистый;
- ацетонитрил, особой чистоты, УФ-200 нм;
- вода дистиллированная по ГОСТ 6709 и (или) бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости);
- гелий, очищенный марки «A»;
- n-Гексан, химически чистый;
- калий марганцовокислый, чистый для анализа, ГОСТ 20490;
- кальций хлористый, чистый;
- кислота ортофосфорная, 85%, чистая для анализа, ГОСТ 6552;
- концентрирующие патроны для твердофазной экстракции с привитыми гидрофобными гексадецильными группами с постоянной активностью с размером частиц 63 — 200 мкм (C16) (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) (патрон № 1);
- концентрирующие патроны для твердофазной экстракции с гидрофильным слабокислым сорбентом с постоянной активностью с размером частиц 63 — 200 мкм (C-силикагель) (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г), (патрон № 2);
- метилен хлористый, химически чистый;
- натрий сернокислый, безводный, химически чистый, ГОСТ 4166;
- натрий углекислый, кислый, химически чистый, ГОСТ 4201;
- натрий хлористый, химически чистый, ГОСТ 4233;
- флорисил (магния силикат, 99%) для колоночной хроматографии, зернение 60/100 меш;
- этилацетат, чистый для анализа, ГОСТ 22300;
- эфир метил-трет-бутиловый (далее — МТБЭ), чистый для анализа.
5.3 Вспомогательные устройства, материалы:
- аллонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами — ГОСТ 25336;
- банки полипропиленовые с крышками для экстракции вместимостью 250 см3;
- ванна ультразвуковая с потребляемой мощностью 140 Вт, рабочей частотой 50 Гц, рабочим объемом 4,5 дм3;
- вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная, ГОСТ 5556;
- виалы объемом 2 см3, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, прокалываемой микрошприцем для автоматического дозатора проб;
- воронки делительные на 250 см3, ГОСТ 25336;
- воронки лабораторные, стеклянные, ГОСТ 25336;
- испаритель ротационный вакуумный с ручным подъемником, с диагональным конденсором и объемом испарительной колбы от 50 до 3000 см3, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об/мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом 5 дм3 и с диапазоном температур от плюс 20 до плюс 100 °C;
- колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1000 см3, ГОСТ 25336;
- колбы круглодонные со шлифом на 100, 250 см3 и 4000 см3 ТС;
- колонка хроматографическая стальная, длиной 150 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18;
- насос диафрагменный, химически стойкий на 100%, с мощностью электропривода 245 Вт, предельным вакуумом 100 мбар/абс, с избыточным давлением 1 бар и скоростью откачки 34 дм3/мин;
- предколонка хроматографическая, длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18;
- стаканы стеклянные, термостойкие объемом 100 — 1000 см3, ГОСТ 25336;
- установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4000 см3 и приемной конической колбой объемом 1000 см3;
- фильтры мембранные для очистки растворителей, диаметром 47 мм с отверстиями пор 0,45 мкм;
- фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие, диаметром 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г;
- шприц инъекционный многократного применения объемом 10 см3, ГОСТ 22967.
Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, а также посуды, реактивов и материалов, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам.
VI. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
VII. КВАЛИФИКАЦИЯ ОПЕРАТОРОВ
7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на газовом хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VIII. ОТБОР ПРОБ
8.1. Отбор проб производится в соответствии с правилами <1>.
<1> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79.
Пробы зерна кукурузы и семян масличных культур подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света и хранят в бумажной или тканевой упаковке в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Пробы растительных масел хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 10 суток.
IX. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
9.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
X. ПОДГОТОВКА К ОПРЕДЕЛЕНИЮ
10.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с флорисилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с флорисилом, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах № 1 и № 2, установление градуировочной характеристики.
Подготовка органических растворителей.
10.1.1 Очистка ацетонитрила.
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3.
Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре плюс 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 81,5 °C, отбрасывают.
10.1.2 Очистка хлористого метилена.
Хлористый метилен промывают равным объемом 5% раствора натрия углекислого кислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 12 — 24 часов. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре плюс 40,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 40,0 °C, отбрасывают.
10.1.3 Очистка гексана.
Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Гексан перегоняют при температуре плюс 68,7 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 68,7 °C, отбрасывают.
10.1.4 Очистка МТБЭ.
МТБЭ предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем МТБЭ сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
МТБЭ перегоняют при температуре плюс 55,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 55,2 °C, отбрасывают.
10.1.5 Очистка ацетона.
Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3. Ацетон перегоняют при температуре плюс 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 56,2 °C, отбрасывают.
10.1.6 Приготовление бидистиллированной воды.
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3 и кипятят в течение 6 часов.
Собирают фракции, отогнанные при температуре плюс 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 100,0 °C, отбрасывают.
10.2 Приготовление растворов для проведения анализа.
10.2.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ.
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, бидистиллированную воду и ортофосфорную кислоту. Ацетонитрил и бидистиллированную воду предварительно фильтруют через мембранные фильтры для очистки растворителей.
В плоскодонную колбу объемом 1000 см3 помещают 600 см3 ацетонитрила и 400 см3 0,05% водного раствора ортофосфорной кислоты. Смесь тщательно перемешивают.
При использовании градиентного режима хроматографирования компоненты подвижной фазы помещают в разные емкости.
В случае отсутствия в составе хроматографической системы автоматического дегазатора, через раствор подвижной фазы пропускают газообразный гелий со скоростью 20 см3/мин в течение 5 минут, после чего его помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.
10.2.2 Приготовление рабочих растворов.
10.2.2.1 Приготовление 0,05% водного раствора ортофосфорной кислоты.
В мерную колбу объемом 1000 см3 помещают 500 см3 бидистиллированной воды, прибавляют 0,35 см3 85,0%-ной ортофосфорной кислоты, доводят объем профильтрованной через мембранный фильтр бидистиллированной водой до метки и перемешивают. Раствор используют в качестве компонента подвижной фазы для хроматографического анализа.
10.2.2.2 Приготовление насыщенного раствора хлористого натрия.
400 г хлорида натрия переносят в мерную колбу объемом 1000 см3, доливают 800 см3 дистиллированной воды, помещают на 15 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 30 минут на аппарат для встряхивания проб. Получают насыщенный раствор хлорида натрия над слоем нерастворившейся соли.
10.2.2.3 Приготовление 5% раствора гидрокарбоната натрия.
50 г гидрокарбоната натрия переносят в мерную колбу на 1000 см3, добавляют 200 — 300 см3 дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.
10.2.3 Приготовление градуировочных растворов.
10.2.3.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией ипконазола 100,0 мкг/см3.
Взвешивают 10 мг ипконазола в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.
10.2.3.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией ипконазола 10,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.
10.2.3.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией ипконазола 1,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 3 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.
10.2.3.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией ипконазола 0,5 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.
10.2.3.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией ипконазола 0,2 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 2 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.
10.2.3.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией ипконазола 0,1 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.
10.2.3.7. Стандартный раствор № 7 с концентрацией ипконазола 0,05 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 7 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.
10.2.3.8. Стандартные растворы ипконазола с концентрацией 2,0; 1,0; 0,4; 0,2 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,4; 0,2 мкг/см3 и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы и для проверки хроматографического поведения ипконазола на концентрирующих патронах № 1 и 2 и на колонках с флорисилом. Стандартные растворы для внесения готовят непосредственно перед использованием.
10.2.3.9. Стандартные растворы ипконазола с концентрацией 2,0; 1,0; 0,4 и 0,2 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы масла.
Методом последовательного разведения ацетоном стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,4 и 0,2 мкг/см3 и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы масла. Стандартные растворы для внесения готовят перед использованием.
10.3 Установление градуировочной характеристики.
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации ипконазола в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-и растворам для градуировки с концентрацией 1,00; 0,50; 0,20 и 0,10 и 0,05 мкг/см3.
В инжектор хроматографа вводят по 10 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 11.3. Осуществляют не менее 5-ти параллельных измерений.
10.4. Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения ипконазола на них.
10.4.1 Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 1 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см3 ацетонитрила, затем 5 см3 воды. Элюаты отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
10.4.2. Проверка хроматографического поведения ипконазола на концентрирующих патронах № 1.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора ипконазола в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетонитрила, обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 бидистиллированной воды, перемешивают и вносят раствор на подготовленный патрон. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу обмывают 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:2 и тремя порциями по 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и последовательно вносят их на патрон. Каждую порцию собирают отдельно в отгонные колбы объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила водой в соотношении 1:1 и 10 мм3 хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие ипконазол, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения ипконазола на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
10.5. Подготовка концентрирующих патронов 2 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения ипконазола на них.
10.5.1 Подготовка концентрирующих патронов № 2 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 2 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см3 гексана. Элюат отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
10.5.2. Проверка хроматографического поведения ипконазола на концентрирующих патронах № 2.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора ипконазола в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 5 см3 гексана, обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленный патрон. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу обмывают 10 см3 гексана, 5 см3 смеси гексана с МТБЭ в соотношении 1:1 и тремя порциями по 10 см3 каждая ацетона и последовательно вносят их на патрон. Каждую порцию собирают отдельно в отгонную колбу объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила водой в соотношении 1:1 и 10 мм3 хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие ипконазол, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения ипконазола на концентрирующих патронах № 2 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
10.6. Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения ипконазола на них.
10.6.1 Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта.
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г флорисила с зернением 60/100 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой флорисила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см.
В день использования колонку промывают 20 см3 ацетона и 10 см3 гексана. Элюаты отбрасывают.
10.6.2. Проверка хроматографического поведения ипконазола на колонке с флорисилом.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора ипконазола в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетона, обмывают стенки колбы, добавляют 4 см3 гексана, перемешивают и вносят раствор на подготовленную колонку. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу обмывают 5 см3 гексана, 5 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1 и тремя порциями по 10 см3 каждая смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в отгонную колбу объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила водой в соотношении 1:1 и 10 мм3 хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие ипконазола, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.
Изучение поведения ипконазола на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии флорисила.
10.7 Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии
Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре плюс 30 °C в течение 3 — 4 часов.
XI. ПРОВЕДЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ
11.1 Зерно кукурузы, семена сои и подсолнечника.
11.1.1 Экстракция.
Образец измельченного зерна или семян массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 50 см3 этилацетата и помещают на 15 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в отгонную колбу объемом 250 см3 через бумажный фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще двумя порциями по 50 см3 этилацетата на 15 минут в ультразвуковой ванне. Экстракты фильтруют, объединяют в отгонной колбе объемом 250 см3 и упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Маслянистый остаток в колбе, полученный по п. 11.1.1, растворяют в 50 см3 ацетонитрила, тщательно обмывая стенки колбы, и переносят смыв в делительную воронку объемом 250 см3. К ацетонитрильному экстракту прибавляют 30 см3 гексана и встряхивают делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний слой (ацетонитрил) возвращают в делительную воронку и повторяют процедуру еще раз, используя 30 см3 гексана. Нижний ацетонитрильный слой собирают в отгонную колбу объемом 250 см3, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают до масляного остатка при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.3. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Маслянистый остаток в колбе, полученный по п. 11.1.2, растворяют в 3 см3 ацетона, тщательно обмывая стенки колбы, прибавляют 80 см3 дистиллированной воды и 10 см3 насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят смыв в делительную воронку объемом 250 см3.
Ипконазол экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 см3, каждый раз встряхивая делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в конической колбе объемом 250 см3. Верхний (водный) слой отбрасывают.
Хлористый метилен из колбы переносят в делительную воронку объемом 250 см3 и промывают двумя порциями по 30 см3 каждая 5% раствора гидрокарбоната натрия, встряхивая делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний водный слой отбрасывают, а нижний слой (хлористый метилен) собирают в отгонную колбу объемом 250 см3, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.4 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
Сухой остаток, полученный по п. 10.1.4, растворяют в 1 см3 ацетонитрила, тщательно обмывая стенки колбы, добавляют 9 см3 бидистиллированной воды, перемешивают и вносят раствор на подготовленный патрон. Колбу обмывают 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:2 и последовательно вносят их на патрон, элюаты отбрасывают. Ипконазол элюируют с патрона 20 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.5 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2.
Сухой остаток, полученный по п. 10.1.4, растворяют в 5 см3 гексана, тщательно обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленный патрон. Колбу обмывают 10 см3 гексана, 5 см3 смеси гексана с МТБЭ в соотношении 1:1 и последовательно вносят их на патрон, элюаты отбрасывают. Ипконазол элюируют с патрона 20 см3 ацетона. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.6 Очистка экстракта на колонке с флорисилом.
Сухой остаток, полученный по п. 10.1.5, растворяют в 1 см3 ацетона, тщательно обмывают стенки колбы, добавляют 4 см3 гексана, перемешивают и вносят раствор на подготовленную колонку. Колбу обмывают 5 см3 гексана, 5 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1 и последовательно вносят их на патрон, элюаты отбрасывают. Ипконазол элюируют с колонки 20 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.2 Растительные масла.
11.2.1 Экстракция.
Образец масла сои массой 20 г помещают в химический стакан объемом 100 см3, прибавляют 25 см3 гексана, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см3. Химический стакан обмывают еще одной порцией гексана объемом 25 см3 и объединяют с первым смывом в делительной воронке объемом 250 см3.
Химический стакан обмывают 30 см3 ацетонитрила, переносят в делительную воронку с гексановым экстрактом и интенсивно встряхивают 2 минуты. После разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в отгонную колбу объемом 250 см3. Ипконазол экстрагируют еще двумя порциями ацетонитрила объемом по 30 см3 каждая, встряхивая делительную воронку 2 минуты. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой объединяют в колбе объемом 250 см3 и упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку экстракта, как указано в п. 11.1.3. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 11.1.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1 по п. 11.1.5. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2 и п. 11.1.6. Очистка экстракта на колонке с флорисилом.
Сухой остаток растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 10 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.3 Условия хроматографирования.
11.3.1 Хроматографическая система.
Колонка хроматографическая стальная, длиной 150 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Предколонка хроматографическая, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Температура колонки: плюс 30 °C.
Подвижная фаза: ацетонитрил с 0,05% водным раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 60:40.
Скорость потока элюента: 0,75 см3/мин.
Чувствительность не менее 10 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.
Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор ипконазола с концентрацией 1,0 мкг/см3, соответственно разбавляют.
XII. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ
12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание ипконазола в пробах рассчитывают по формуле, без учета полноты извлечения вещества из проб:
X = \frac{S_{\text{пр}}AV}{100S_{\text{ст}}m} P,
где X — содержание ипконазола в пробе, мг/кг;
Sст — высота (площадь) пика стандарта, мм;
Sпр — высота (площадь) пика образца, мм;
A — концентрация стандартного раствора, мкг/см3;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г;
P — содержание ипконазола в аналитическом стандарте, %.
XIII. ПРОВЕРКА ПРИЕМЛЕМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ ПАРАЛЛЕЛЬНЫХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ
13.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |\text{Х}_{1} - \text{Х}_{2}|}{(\text{Х}_{1} + \text{Х}_{2})} \leq r, (1)
где X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг или мг/дм3;
r — значение предела повторяемости (таблица 1), при этом r = 2,8 \times \sigma_{r} .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XIV. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
14.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta\overline{X}}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
- при определении остаточного количества ипконазола в зерне кукурузы, семенах масличных культур (сои, подсолнечника) и в растительных маслах содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг.
XV. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
15.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6.
Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание ипконазола в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 1,0 мкг/см3.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
A = \frac{(X - C)100}{C} \leq 10,
где X — концентрация ипконазола контрольного измерения, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора ипконазола в смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему), взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
10 — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов ипконазола, предусмотренных методикой выполнения измерения. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 10.3.
15.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:
C_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},\text{Х}} + \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime},
где \pm \Delta_{\text{л},\text{Х}}( \pm \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,
где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta\overline{X}}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
\text{К}_{\text{к}} = \overline{\text{Х}}\prime - \overline{\text{Х}} - \text{С}_{\text{д}},
где \overline{\text{Х}}\prime , \overline{\text{Х}} , Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 12), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}} .
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
15.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):
\frac{2|\text{Х}_{1} - \text{Х}_{2}| \cdot 100}{(\text{Х}_{1} + \text{Х}_{2})} \leq R, (3)
где X1, X2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ИПКОНАЗОЛА ИЗ ЗЕРНА КУКУРУЗЫ, СЕМЯН МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР (СОИ, ПОДСОЛНЕЧНИКА) И ИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ (5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, P = 0,95)
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. ГОСТ Р 8.563 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений».
3. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6) «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
4. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
5. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
6. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
7. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
8. ГОСТ 12.4.009 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
9. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
10. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
11. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
12. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
13. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
14. ГОСТ 6709 «Вода дистиллированная. Технические условия».
15. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
16. ГОСТ 5556 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».
17. ГОСТ 9293 «Азот газообразный и жидкий. Технические условия».
18. ГОСТ 2603 «Реактивы. Ацетон. Технические условия»
19. ГОСТ 20490 «Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия».
20. ГОСТ 4166 «Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия».
21. ГОСТ 4201 «Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия».
22. ГОСТ 4233 «Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».
23. ГОСТ 33884 «Свекла сахарная. Технические условия».
24. ГОСТ 10852 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».
25. ГОСТ 22391 «Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках».
26. ГОСТ 1129 «Масло подсолнечное. Технические условия».
27. ГОСТ 17109 «Соя. Требования при заготовках и поставках».
28. ГОСТ 31760 «Масло соевое. Технические условия».
29. ГОСТ 32190 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб».
30. ГОСТ 13586.3 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб».
31. ГОСТ 8808 «Масло кукурузное. Технические условия».
32. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79.