МУК 4.1.3951-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фомесафена в зерне гороха и нута методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 05.07.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 05.10.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 5 июля 2023 года
Дата введения 5 октября 2023 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФОМЕСАФЕНА В ЗЕРНЕ ГОРОХА И НУТА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3951-23
1. Разработаны ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр „Агроэкология пестицидов и агрохимикатов“ Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, О.И. Рыбакова, Е.Н. Тестова, П.В. Рязанцев).»
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 5 июля 2023 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) для определения уровня остаточных количеств фомесафена в зерне гороха и нута в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические свойства
2.1 Физико-химические свойства фомесафена.
Название действующего вещества по ИЮПАК: 5-[2-хлор-4-(трифторметил) фенокси]-N-метилсульфонил-2-нитробензамид.
Эмпирическая формула: C15H10ClF3N2O6S.
Агрегатное состояние: белое кристаллическое твердое вещество.
Цвет, запах: белый или бесцветный, без запаха.
Давление насыщенного пара (при плюс 20 °C): 4,0 x 10-6 Па.
Температура плавления: плюс 220 °C.
Коэффициент распределения в системе октанол/вода: KowlogP = 2,83.
Растворимость в воде зависит от значения pH (в мг/дм3 при плюс 20 °C): 50 мг/дм3 при pH 7, менее 1 мг/дм3 при pH 1 ~ 2.
Растворимость в органических растворителях (в г/дм3): ацетон — 300; циклогексан — 150; метанол — 25; дихлорметан — 10; ксилол — 1,9; гексан — 0,5.
При нагревании до разложения испускает токсичные пары из оксида серы, оксида азота, фтористый водород и хлористый водород.
В почве в анаэробных условиях разлагается в течение 3 недель, в аэробных условиях ДТ50 варьируется от 6 до 12 месяцев.
2.2. Фомесафен относится к малоопасным веществам по острой оральной токсичности (ЛД50 для крыс 1250 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по дермальной (ЛД50 для кроликов более 1000 мг/кг) и по ингаляционной токсичности (ЛК50 для крыс (4 часа) более 4970 мг/м3 воздуха).
2.3. Фомесафен — высокоселективный довсходовый и послевсходовый гербицид контактного действия. Применяется на посевах хлопка, сои. Эффективен против однолетних и многолетних широколиственных и злаковых сорняков. Попадая в растение через листья и корни, ингибирует протопорфириногеноксидазу, приводящую к необратимому повреждению клеточной мембраны.
III. Метод измерения
3.1. Метод основан на определении фомесафена методом ВЭЖХ с использованием диодно-матричного детектора.
3.2. Определение фомесафена в зерне гороха проводится после его экстракции из образцов ацетонитрилом, дальнейшей очистки экстракта перераспределением между несмешивающимися растворителями на концентрирующих патронах № 1 с гидрофобным сорбентом с привитыми октильными группами и на колонке с окисью алюминия.
Определение фомесафена в зерне нута проводится после его экстракции из образцов ацетоном, дальнейшей очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами на концентрирующих патронах № 1 с гидрофобным сорбентом с привитыми октильными группами и на колонке с окисью алюминия.
3.3. Идентификация вещества проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
3.4. В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
IV. Метрологические характеристики
4.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические характеристики
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 2 - 4.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Хроматограф жидкостной с диодно-матричным детектором | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Весы аналитические | Наибольший предел взвешивания 110 г, дискретность 0,0001 г, класс точности специальный (I) по ГОСТ Р 53228 |
| Весы лабораторные | Наибольший предел взвешивания 400 г, предел допустимой погрешности +/- 0,5 г, класс точности средний (III) по ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные лабораторные стеклянные | Тип 2-10-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2 и 2-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные лабораторные стеклянные | Тип 1-2-2-1, 1-2-2-2 и 1-2-2-5 по ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные лабораторные стеклянные | Тип 1-10-2, 1-25-2, 1-50-2, 1-100-2, 1-250-2, 1-500-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Фомесафен, аналитический стандарт | Содержание основного вещества не менее 98,5% |
| Алюминий окись | Нейтральная, размер частиц 50 — 200 мкм |
| Ацетон химически чистый | ГОСТ 2603 |
| Ацетонитрил химически чистый | Содержание основного вещества не менее 99,8% |
| Ацетонитрил для ВЭЖХ | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| Вода дистиллированная | ГОСТ Р 58144 |
| Вода для лабораторного анализа | ГОСТ Р 52501 |
| Гелий очищенный | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| н-Гексан химически чистый | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Калий марганцовокислый чистый для анализа | ГОСТ 20490 |
| Кальций хлористый чистый для анализа | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Кислота муравьиная для анализа | Содержание основного вещества не менее 98% |
| Кислота уксусная химически чистая ледяная | ГОСТ 61 |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции (патрон № 1) | Заполнены гидрофобным сорбентом с размером частиц 63 — 200 мкм с привитыми октильными (C8) группами (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) |
Вспомогательные устройства, материалы
| Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Алонж прямой стеклянный | Тип АО по ГОСТ 25336 |
| Аппарат для встряхивания проб | Направление колебаний — возвратно-поступательное, максимальная загрузка 10 кг, амплитуда колебаний — до 30 мм, скорость от 10 до 300 колебаний в минуту |
| Банки полипропиленовые с крышками для экстракции | Объем 250 см3 |
| Ванна ультразвуковая | Рабочая частота 50 Гц |
| Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная | ГОСТ 5556 |
| Виалы, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, для жидких проб | Объем 2 см3 |
| Виалы стеклянные с крышкой с тефлоновой прокладкой | Объем не менее 40 см3 |
| Воронки делительные | Тип ВД по ГОСТ 25336 |
| Воронки лабораторные стеклянные | Тип В по ГОСТ 25336 |
| Колбы конические стеклянные | Тип Кн по ГОСТ 25336 |
| Колбы круглодонные стеклянные | Тип К по ГОСТ 25336 |
| Колонка хроматографическая стальная | Заполнена сорбентом с привитыми полярными группами C18; линейные размеры 150 мм x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм |
| Колонки хроматографические, стеклянные или пластиковые | Длина 150 — 250 мм, диаметр 15 мм |
| Насос мембранный вакуумный | Обеспечивающий вакуум до 10 мбар |
| Предколонка хроматографическая стальная | Заполнена сорбентом с привитыми неполярными группами C18; линейные размеры 12,5 мм x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм |
| Ротационный вакуумный испаритель | Снабжен ручным подъемником, с диагональным конденсатором и объемом испарительной колбы от 50 до 3000 см3, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об/мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом не менее 5 дм3 и с диапазоном температур плюс 20 — 100 °C |
| Стаканы лабораторные стеклянные | Тип В, номинальная вместимость 100 — 800 см3 по ГОСТ 25336 |
| Установка для перегонки растворителей | С круглодонной колбой объемом 4000 см3 и приемной конической колбой объемом 1000 см3 |
| Фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие | Диаметр 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г |
| Фильтры мембранные для очистки растворителей | Диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм |
| Шприц инъекционный многократного применения | Объем 10 см3 по ГОСТ 22967 |
Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, а также посуды, реактивов и материалов, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
VII. Квалификация операторов
7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на газовом хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VIII. Отбор проб
8.1. Отбор проб производится в соответствии с правилами <1>.
<1> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79.
Пробы зерна гороха и нута подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света и хранят в бумажной или тканевой упаковке в сухом хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
IX. Условия проведения измерений
9.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 — 30 °C, относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
X. Подготовка к выполнению измерений
10.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах № 1 и на колонке с окисью алюминия, установление градуировочной характеристики.
Подготовка органических растворителей.
10.1.1 Очистка ацетонитрила.
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре плюс 81,0 — 82,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 81,0 — 82,0 °C, отбрасывают.
10.1.2 Очистка гексана.
Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Гексан перегоняют при температуре плюс 68,5 — 69,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 68,5 — 69,0 °C, отбрасывают.
10.1.3 Очистка ацетона
Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/дм3. Ацетон перегоняют при температуре плюс 56,0 — 56,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 56,0 — 56,5 °C, отбрасывают.
10.1.4 Приготовление бидистиллированной воды.
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3 и кипятят в течение 6 часов.
Собирают фракции, отогнанные при температуре плюс 99,5 — 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 99,5 — 100,0 °C, отбрасывают.
10.2 Приготовление растворов для проведения анализа.
10.2.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ.
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, бидистиллированную воду и муравьиную кислоту. Ацетонитрил и бидистиллированную воду предварительно фильтруют через мембранные фильтры для очистки растворителей.
В плоскодонную колбу объемом 1000 см3 помещают 600 см3 ацетонитрила и 400 см3 0,05%-го водного раствора муравьиной кислоты в воде. Смесь тщательно перемешивают.
При использовании градиентного режима хроматографирования компоненты подвижной фазы помещают в разные емкости.
В случае отсутствия в составе хроматографической системы автоматического дегазатора через раствор подвижной фазы пропускают газообразный гелий со скоростью 20 см3/мин в течение 5 минут, после чего его помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.
Приготовленный раствор подвижной фазы хранится при комнатной температуре не более пяти дней.
10.2.2 Приготовление рабочих растворов.
10.2.2.1. Приготовление 0,05%-го водного раствора муравьиной кислоты в воде.
В мерную колбу объемом 1000 см3 помещают 500 см3 бидистиллированной воды, прибавляют 0,5 см3 муравьиной кислоты и доводят до метки бидистиллированной водой. Раствор используется в качестве компонента подвижной фазы и хранится при комнатной температуре не более пяти дней.
10.2.2.2. Приготовление смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99:1 (по объему).
В мерную колбу объемом 100 см3 помещают 50 см3 ацетонитрила, прибавляют 1 см3 ледяной уксусной кислоты, перемешивают и доводят ацетонитрилом объем в колбе до метки. Раствор используют при очистке экстракта на колонке с окисью алюминия и готовят непосредственно перед использованием.
10.2.2.3. Приготовление 0,1%-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле.
В мерную колбу объемом 100 см3 помещают 50 см3 ацетонитрила, прибавляют 0,1 см3 ледяной уксусной кислоты, перемешивают и доводят ацетонитрилом объем в колбе до метки. Раствор используют при очистке экстракта на колонке с окисью алюминия и готовят непосредственно перед использованием.
10.2.3 Приготовление градуировочных растворов.
10.2.3.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией фомесафена 100,0 мкг/см3.
Взвешивают 10 мг фомесафена в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более 6 месяцев.
10.2.3.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией фомесафена 10,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики и для внесения в контрольные образцы матриц. Стандартный раствор № 2 хранится в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более 3 месяцев.
10.2.3.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией фомесафена 1,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 3 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более 3 месяцев.
10.2.3.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией фомесафена 0,5 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более 3 месяцев.
10.2.3.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией фомесафена 0,2 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 2 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более 3 месяцев.
10.2.3.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией фомесафена 0,1 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более 3 месяцев.
10.2.3.7. Стандартный раствор № 7 с концентрацией фомесафена 0,05 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 6 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 7 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более 3 месяцев.
10.2.3.8. Стандартные растворы фомесафена с концентрациями 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы матриц.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом из стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 фомесафена и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы матриц. Стандартные растворы для внесения хранятся в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C не более 3 месяцев.
10.3. Установление и контроль стабильности градуировочной характеристики.
10.3.1 Установление градуировочной характеристики.
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации фомесафена в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 и 0,05 мкг/см3.
В инжектор хроматографа вводят по 30 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 11.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
10.3.2 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание фомесафена в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 1,0 мкг/см3.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
A = \frac{(X - C) \times 100}{C} \leq 10
где X — концентрация фомесафена контрольного измерения, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора фомесафена в смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему), взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
10 — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов фомесафена, предусмотренных методикой выполнения измерения. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 10.3.1.
10.4. Подготовка концентрирующих патронов № 1 с гидрофобным сорбентом с привитыми октильными группами для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения фомесафена на них.
10.4.1 Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, затем 10 см3 воды. Элюаты отбрасывают.
10.4.2. Проверка хроматографического поведения фомесафена на концентрирующих патронах № 1.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора фомесафена в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленный патрон. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу обмывают 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и вносят раствор на патрон. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие фомесафен, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения фомесафена на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
10.5. Подготовка колонки с 3 г окиси алюминия для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения фомесафена на ней.
10.5.1 Подготовка колонки с 3 г окиси алюминия для очистки экстракта.
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Колонку с окисью алюминия устанавливают на алонж с отводом для вакуума.
Кондиционирование: колонку промывают 10 см3 ацетонитрила. Элюаты отбрасывают.
10.5.2. Проверка хроматографического поведения фомесафена на колонке с 3 г окиси алюминия.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора фомесафена в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 10 см3 ацетонитрила, обмывают стенки колбы и вносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу последовательно обмывают 10 см3 ацетонитрила, двумя порциями по 10 см3 0,1%-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле, двумя порциями по 10 см3 смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99:1 и двумя порциями по 5 см3 смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99:1. Растворы последовательно вносят на колонку. Элюаты собирают в чистые отгонные колбы объемом по 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие фомесафен, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.
Изучение поведения фомесафена на колонках с окисью алюминия проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.
10.6. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.
Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют ее при температуре плюс 30 °C в течение 3 — 4 часов, промывая подвижной фазой, приготовленной по п. 10.2.1, при скорости подачи растворителя 0,6 см3/мин.
XI. Проведение измерений
11.1 Зерно гороха.
11.1.1. Экстракция и очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Образец измельченного зерна гороха массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 50 см3 ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в делительную воронку объемом 250 см3. Экстракцию повторяют еще один раз в тех же условиях, используя 50 см3 ацетонитрила. Экстракты фильтруют, объединяют в делительной воронке объемом 250 см3.
К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 50 см3 гексана и встряхивают делительную воронку в течение 2 минут. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой собирают в отгонную колбу объемом 250 см3 и выпаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.2 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
Сухой остаток, полученный по п. 11.1.1, растворяют в 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, тщательно обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленный по п. 10.4.1. концентрирующий патрон № 1. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.3 Очистка экстракта на колонке с 3 г окиси алюминия.
Сухой остаток, полученный по п. 10.1.2, растворяют в 10 см3 ацетонитрила, обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленную по п. 10.5.1 колонку с окисью алюминия, элюат отбрасывают.
Исходную колбу обмывают 10 см3 ацетонитрила, затем 20 см3 0,1%-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле и последовательно вносят их на колонку, элюаты отбрасывают.
Фомесафен элюируют с колонки 25 см3 смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99:1, элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Отдувают током холодного воздуха до исчезновения запаха уксусной кислоты.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему) и 30 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.2 Зерно нута.
11.2.1 Экстракция.
Образец измельченного зерна нута массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 50 см3 ацетона и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см3. Экстракцию повторяют еще один раз в тех же условиях, используя 50 см3 ацетона. Экстракты фильтруют, объединяют в отгонной колбе объемом 250 см3 и выпаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.
11.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Сухой остаток, полученный по п. 11.2.1, растворяют в 3 см3 ацетонитрила, тщательно обмывают стенки колбы, добавляют 50 см3 гексана, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см3.
Фомесафен экстрагируют тремя порциями ацетонитрила по 20 см3, каждый раз интенсивно встряхивая воронку в течение 2 минут. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний слой (ацетонитрил) объединяют в отгонной колбе объемом 250 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку по п. 11.1.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1 и по п. 11.1.3. Очистка экстракта на колонке с 3 г окиси алюминия.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему) и 30 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.3 Условия хроматографирования.
11.3.1 Хроматографическая система, включающая:
- хроматограф жидкостной с диодно-матричным детектором, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от плюс 15 до плюс 80 °C, и с возможностью использования стандартного автосамплера с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм3 для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;
- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.
Колонка хроматографическая стальная, заполненная сорбентом с привитыми неполярными группами C18.
Предколонка хроматографическая стальная, заполненная сорбентом с привитыми неполярными группами C18.
Температура колонки: плюс 30 °C.
Подвижная фаза: смесь ацетонитрила с 0,05%-м водным раствором муравьиной кислоты в соотношении 60:40 (по объему) при хроматографировании в изократическом режиме. Соотношение в режиме градиентного элюирования ацетонитрила с 0,05%-м водным раствором муравьиной кислоты (%, по объему): до 10 мин — 60:40; с 11 по 14 мин — 90:10; с 15 по 20 мин — 60:40.
Скорость потока элюента: 0,6 см3/мин.
Чувствительность не менее 10 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 0,05 — 1,00 нг.
Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор фомесафена с концентрацией 1,0 мкг/см3, соответственно разбавляют. В этом случае разбавление учитывают в конечной формуле расчета содержания фомесафена в пробах.
Примечание. При хроматографировании проб зерна гороха и нута длительность инъекции должна быть не менее 25 мин при работе в изократическом режиме в указанных выше условиях хроматографирования для того, чтобы выходящие в этот интервал времени матричные пики не искажали результат следующего хроматографического анализа.
XII. Обработка результатов измерения
12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание фомесафена в пробах рассчитывают по формуле, без учета полноты извлечения вещества из проб:
где X — содержание фомесафена в пробе, мг/кг;
A — концентрация фомесафена, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см3;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г.
XIII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
13.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r
где X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 \times \sigma_{r} .
При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XIV. Оформление результатов
14.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} , при вероятности P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \delta \cdot \overline{X}100 ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «Содержание фомесафена в зерне гороха и нута — менее 0,01 мг/кг».
XV. Контроль качества результатов измерений
15.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6).
Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ФОМЕСАФЕНА ИЗ ЗЕРНА ГОРОХА И НУТА (5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, P = 0,95)
| Среда | Внесено фомесафена, мг/кг | Полнота извлечения, % |
| Зерно гороха | 0,01 | 89,8 |
| 0,02 | 79,7 | |
| 0,05 | 81,8 | |
| 0,10 | 78,3 | |
| Зерно нута | 0,01 | 80,9 |
| 0,02 | 83,5 | |
| 0,05 | 84,3 | |
| 0,10 | 81,4 |
Библиографические ссылки
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. ГОСТ Р 8.563 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений».
3. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6) «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
4. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
5. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
6. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
7. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
8. ГОСТ 12.4.009 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
9. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
10. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
11. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
12. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
13. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
14. ГОСТ Р 58144 «Вода дистиллированная. Технические условия».
15. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
16. ГОСТ 5556 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».
17. ГОСТ 9293 «Азот газообразный и жидкий. Технические условия».
18. ГОСТ 2603 «Реактивы. Ацетон. Технические условия»
19. ГОСТ 20490 «Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия».
20. ГОСТ 4166 «Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия».
21. ГОСТ 4233 «Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».
22. ГОСТ 13586.3 «Зерно. Правила приемки и методы»
| ББК 51.231 |
|---|