МУК 4.1.3945-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флорпирауксифен-бензила и его метаболита флорпирауксифена в зеленой массе, зерне и масле кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 04.07.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 04.10.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 4 июля 2023 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЛОРПИРАУКСИФЕН-БЕНЗИЛА И ЕГО МЕТАБОЛИТА ФЛОРПИРАУКСИФЕНА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ЗЕРНЕ И МАСЛЕ КУКУРУЗЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3945-23
Дата введения 4 октября 2023 года
1. Разработаны ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр „Агроэкология пестицидов и агрохимикатов“ Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, Е.Н. Тестова).»
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 4 июля 2023 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектированием для определения уровня остаточных количеств флорпирауксифен-бензила и его метаболита флорпирауксифена в зеленой массе кукурузы в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг каждого вещества, а также в зерне и масле кукурузы в диапазоне 0,005 — 0,05 мг/кг каждого вещества.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические свойства
2.1. Физико-химические свойства флорпирауксифен-бензила и его метаболита флорпирауксифена.
2.1.1 Физико-химические свойства флорпирауксифен-бензила.
Название вещества по ИЮПАК: бензил 4-амино-3-хлоро-6-(4-хлоро-2-фторо-3-метоксифенил)-5-фторпиридин-2-карбоксилат.
Эмпирическая формула: C20H14Cl2F2N2O3.
Агрегатное состояние: порошок.
Цвет, запах: от белого до бежевого, с легким запахом.
Давление насыщенного пара (при плюс 20 °C): 3,2 x 10-5 Па.
Температура плавления: плюс 137,1 °C.
Коэффициент распределения в системе октанол/вода (при плюс 20 °C и pH 7): Kowlog P = 5,46.
Растворимость в воде (в мг/дм3 при плюс 20 °C): 0,011.
Растворимость в органических растворителях (в г/дм3 при плюс 20 °C): ацетон — 210; этилацетат — 120; 1,2-дихлорэтан — 95; ксилол — 14; метанол — 13; н-гептан — 0,053.
Флорпирауксифен-бензил подвергается гидролизу, DT50 составляет 913 дней при pH 4; 111 дней при pH 7; 1,3 дня при pH 9.
В почве (аэробные условия) DT50 составляет 150 дней.
2.1.2 Физико-химические свойства флорпирауксифена.
Название вещества по ИЮПАК: 4-амино-3-хлоро-6-(4-хлоро-2-фторо-3-метоксифенил)-5-фторпиридин-2-карбоновая кислота.
Эмпирическая формула: C13H8Cl2F2N2O3.
Агрегатное состояние: порошок.
Цвет, запах: от белого до бежевого, с легким запахом.
В почве (аэробные условия) DT50 составляет 39,8 дней.
2.2. Флорпирауксифен-бензил относится к малоопасным веществам по острой оральной (ЛД50 для крыс более 5000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД50 для крыс более 5000 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК50 для крыс (4 часа) более 5230 мг/м3 воздуха). Не вызывает покраснения глаз и кожи у кроликов.
2.3. Флорпирауксифен-бензил — селективный послевсходовый гербицид для контроля злаковых и болотных сорняков.
III. Метод измерения
3.1. Метод основан на определении флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе с использованием тандемного масс-спектрометрического детектора.
Определение флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в зеленой массе, зерне и масле кукурузы проводится после их экстракции из образцов 0,1% раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле, дальнейшей очистки экстракта на концентрирующем патроне № 1 с гидрофобным сорбентом на основе сверхсшитого полистирола, а затем на концентрирующем патроне № 2 с гидрофобным сорбентом с привитыми гексадецильными группами.
Идентификация флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена проводится по временам удерживания, наличию характеристичных фрагментарных ионов и соотношению интенсивностей (площадей) пиков этих ионов. Количественное определение флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена проводится методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность метода достигается за счет использования масс-спектрометрического детектора.
IV. Метрологические характеристики
4.1. При соблюдении всех условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 4.1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические характеристики
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Хроматограф жидкостный с масс-спектрометрическим детектором | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Весы аналитические | Наибольший предел взвешивания 110 г, дискретность 0,0001 г, класс точности специальный (I) по ГОСТ Р 53228 |
| Весы лабораторные | Наибольший предел взвешивания 400 г, предел допустимой погрешности +/- 0,5 г, класс точности средний (III) по ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные лабораторные стеклянные | Тип 2-10-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2 и 2-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные лабораторные стеклянные | Тип 1-2-2-1, 1-2-2-2, 1-2-2-5 и 1-2-2-10 по ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные лабораторные стеклянные | Тип 1-10-2, 1-25-2, 1-50-2, 1-100-2, 1-250-2, 1-500-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Флорпирауксифен-бензил, аналитический стандарт | Содержание основного вещества не менее 99,0% |
| Флорпирауксифен, аналитический стандарт | Содержание основного вещества не менее 99,0% |
| Азот газообразный особой чистоты | ГОСТ 9293 |
| Ацетон химически чистый | ГОСТ 2603 |
| Ацетонитрил химически чистый | Содержание основного вещества не менее 99,8% |
| Ацетонитрил для ВЭЖХ | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| Вода дистиллированная | ГОСТ Р 58144 |
| Вода для лабораторного анализа | ГОСТ Р 52501 |
| Гелий очищенный | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| н-Гексан химически чистый | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Калий марганцовокислый чистый для анализа | ГОСТ 20490 |
| Кальций хлористый чистый для анализа | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Кислота муравьиная для анализа | Содержание основного вещества не менее 98% |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции (патрон № 1) | Заполнены гидрофобным сорбентом на основе сверхсшитого полистирола с размером частиц 50 — 100 мкм и диаметром пор 10 — 1000Е (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции (патрон № 2) | Заполнены гидрофобным сорбентом с привитыми гексадецильными (C16) группами с размером частиц 6 — 200 мкм и диаметром пор 100Е (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) |
| Натрий сернокислый химически чистый | ГОСТ 4166 |
Вспомогательные устройства, материалы
| Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Аллонж прямой стеклянный | Тип АО по ГОСТ 25336 |
| Ванна ультразвуковая | Рабочая частота 50 кГц |
| Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная | ГОСТ 5556 |
| Виалы, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, для жидких проб | Объем 2 см3 |
| Виалы стеклянные с крышкой с тефлоновой прокладкой | Объем не менее 40 см3 |
| Воронки делительные | Тип ВД по ГОСТ 25336 |
| Воронки лабораторные стеклянные | Тип В по ГОСТ 25336 |
| Колбы конические стеклянные | Тип Кн по ГОСТ 25336 |
| Колбы круглодонные стеклянные | Тип К по ГОСТ 25336 |
| Колонка хроматографическая стальная | Заполнена сорбентом с привитыми неполярными группами C18; линейные размеры 150 мм x 4,6 мм, размер частиц 3,5 мкм |
| Колонки хроматографические, стеклянные или пластиковые | Длина 150 — 250 мм, диаметр 15 мм |
| Насос мембранный вакуумный | Обеспечивающий вакуум — до 10 мбар |
| Ротационный вакуумный испаритель | Снабжен ручным подъемником, с диагональным конденсатором и объемом испарительной колбы от 50 до 3000 см3, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об/мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом не менее 5 дм3 и с диапазоном температур 20 — 100 °C |
| Предколонка хроматографическая стальная | Заполнена сорбентом с привитыми неполярными группами C18; линейные размеры 12,5 мм x 2,1 мм, размер частиц 5 мкм |
| Стаканы лабораторные стеклянные | Тип B, номинальная вместимость 100 — 800 см3 по ГОСТ 25336 |
| Установка для перегонки растворителей | С круглодонной колбой объемом 4000 см3 и приемной конической колбой объемом 1000 см3 |
| Фильтры-насадки на шприц для фильтрации проб (шприцевые фильтры) | Размер пор 0,45 мкм |
| Фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие | Диаметр 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г |
| Фильтры мембранные для очистки растворителей | Диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм |
| Шприц инъекционный многократного применения | Объем 10 см3 по ГОСТ 22967 |
Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, а также посуды, реактивов и материалов, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
VII. Квалификация операторов
7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на газовом хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VIII. Отбор проб
8.1. Отбор проб производится в соответствии с правилами <1>.
<1> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79.
Пробы зеленой массы кукурузы хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C до 2 лет.
Пробы зерна кукурузы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света и хранят в бумажной или тканевой упаковке в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Пробы кукурузного масла хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 7 суток.
IX. Условия проведения измерений
9.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 — 30 °C, относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
X. Подготовка к выполнению измерений
10.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах № 1 и № 2, установление градуировочной характеристики.
Подготовка органических растворителей.
10.1.1 Очистка ацетонитрила.
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре плюс 81,0 — 82,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 81,0 — 82,0 °C, отбрасывают.
10.1.2 Очистка ацетона.
Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов.
Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/дм3. Ацетон перегоняют при температуре плюс 56,0 — 56,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 56,0 — 56,5 °C, отбрасывают.
10.1.3 Приготовление бидистиллированной воды.
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3 и кипятят в течение 6 часов.
Собирают фракции, отогнанные при температуре плюс 99,5 — 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 99,5 — 100,0 °C, отбрасывают.
10.2 Приготовление растворов для проведения анализа.
10.2.1 Приготовление рабочих растворов.
10.2.1.1. Приготовление 0,1% водного раствора муравьиной кислоты (подвижная фаза A).
В мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 500 см3 бидистиллированной воды, прибавляют 1,0 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки бидистиллированной водой. Раствор используется как компонент подвижной фазы и хранится при комнатной температуре не более пяти дней.
10.2.1.2. Приготовление 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле (подвижная фаза B).
В мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 500 см3 ацетонитрила, прибавляют 1,0 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки ацетонитрилом. Раствор используется как компонент подвижной фазы, при работе с концентрирующими патронами № 1 и 2, а также при экстракции флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена из образцов зеленой массы и зерна кукурузы. Приготовленный раствор подвижной фазы хранится при комнатной температуре не более пяти дней.
10.2.1.3. Приготовление смеси ацетонитрила с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1 (по объему).
В коническую колбу объемом 250 см3 помещают 100 см3 ацетонитрила, 100 см3 бидистиллированной воды, прибавляют 0,2 см3 муравьиной кислоты и перемешивают. Раствор используется для приготовления градуировочных стандартов и растворения проб и хранится при комнатной температуре не более пяти дней.
10.2.2 Приготовление градуировочных растворов.
10.2.2.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией флорпирауксифен-бензила 100,0 мкг/см3.
Взвешивают 10 мг флорпирауксифен-бензила в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки при перемешивании.
10.2.2.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией флорпирауксифена 100,0 мкг/см3.
Взвешивают 10 мг флорпирауксифена в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании.
Стандартные растворы № 1 и № 2 используют для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочных характеристик и хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 5 месяцев.
10.2.2.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена по 10,0 мкг/см3.
В мерную колбу объемом 100 см3 помещают по 10,0 см3 стандартного раствора № 1 и № 2, доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 3 используют для приготовления растворов для внесения в контрольные образцы. Раствор № 3 хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 5 месяцев.
10.2.2.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена по 1,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см3 раствора и помещают в мерную колбу объемом 10 см3, доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор № 4 используют для приготовления стандартных растворов для установления градуировочных характеристик и для хроматографического исследования. Раствор № 4 хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 5 месяцев.
10.2.2.5. Стандартные растворы флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена с концентрацией по 0,01, 0,02, 0,05, 0,10, 0,20 и 0,25 мкг/см3 для установления градуировочной зависимости для определения флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в зеленой массе кукурузы.
Методом последовательного разведения стандартного раствора № 4 смесью ацетонитрила с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1 (по объему) готовят растворы, содержащие по 0,01, 0,02, 0,05, 0,10, 0,20 и 0,25 мкг/см3 каждого вещества.
Стандартные растворы для установления градуировочной зависимости для определения флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в зеленой массе кукурузы готовят на основе матрицы, растворяя очищенные экстракты контрольных образцов анализируемых матриц, подготовленные по п. 12.1, градуировочными растворами флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена с концентрацией каждого вещества по 0,01, 0,02, 0,05, 0,10, 0,20 и 0,25 мкг/см3. Растворы на основе экстракта матриц хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 14 дней.
10.2.2.6. Стандартные растворы флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена с концентрацией по 0,005, 0,010, 0,020, 0,050, 0,100 и 0,120 мкг/см3 для установления градуировочной зависимости для определения флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в зерне и масле кукурузы.
Методом последовательного разведения стандартного раствора № 4 смесью ацетонитрила с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1 (по объему) готовят растворы, содержащие по 0,005, 0,010, 0,020, 0,050 и 0,100 и 0,120 мкг/см3 каждого вещества.
Стандартные растворы для установления градуировочной зависимости для определения флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в зерне и масле кукурузы готовят на основе матриц, растворяя очищенные экстракты контрольных образцов анализируемых матриц, подготовленные по п. 12.2 или 12.3, градуировочными растворами флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена с концентрацией каждого вещества по 0,005, 0,010, 0,020, 0,050 и 0,100 и 0,120 мкг/см3. Растворы на основе экстракта матриц хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 5 дней.
10.2.2.7. Стандартные растворы флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена с концентрацией по 2,500, 1,000, 0,500, 0,250, 0,100, 0,050 и 0,025 мкг/см3 каждого вещества для внесения в контрольные образцы зеленой массы, зерна и масла кукурузы.
Методом последовательного разведения стандартного раствора № 3 ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 2,500, 1,000, 0,500, 0,250, 0,100, 0,050 и 0,025 мкг/см3 флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена. Подготовленные растворы используют для внесения в контрольные образцы зеленой массы и зерна кукурузы и для проверки хроматографического поведения на концентрирующих патронах № 1 и № 2. Растворы хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 5 месяцев.
Методом последовательного разведения стандартного раствора № 4 ацетоном готовят растворы, содержащие по 0,250, 0,100, 0,050 и 0,025 мкг/см3 флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена. Подготовленные растворы используют для внесения в контрольные образцы масла и хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 5 месяцев.
10.3. Установление и контроль стабильности градуировочной характеристики.
10.3.1 Установление градуировочной характеристики.
Градуировочные характеристики, выражающие зависимость откликов фрагментарных ионов, используемых для количественного определения, от концентрации флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 6 растворам для градуировки.
Градуировочные характеристики для определения флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в зеленой массе кукурузы устанавливают по 6 растворам для градуировки с концентрацией по 0,01, 0,02, 0,05, 0,10, 0,20 и 0,25 мкг/см3 каждого компонента, приготовленным согласно п. 11.2.2.5.
Градуировочные характеристики для определения флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в зерне и масле кукурузы устанавливают по 6 растворам для градуировки с концентрацией по 0,005, 0,010, 0,020, 0,050 и 0,100 и 0,120 мкг/см3 каждого компонента, приготовленным согласно п. 11.2.2.6.
В инжектор хроматографа вводят по 10 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 11.4. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
Производят расчет параметров градуировочных характеристик (при помощи программного обеспечения): формулы зависимости откликов фрагментарных ионов от концентраций флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в растворе, коэффициенты корреляции, которые должны быть не менее 0,995 и регрессионные остатки, которые не должны превышать 20% для каждого уровня градуировочной характеристики.
Если линейность градуировочной характеристики была продемонстрирована, то при анализе серий образцов допускается устанавливать градуировочную характеристику методом абсолютной калибровки при однократном измерении по 5 и более уровням концентраций, охватывающим весь диапазон измерений. Данные для построения градуировочной зависимости набираются перед началом серии анализов и после ее окончания (рамочная калибровка; не менее 10 измерений не менее чем по пяти уровням концентраций). По полученным данным производят расчет параметров градуировочной характеристики. Рекомендуется в серию анализов образцов включать не более 12 инъекций.
10.3.2 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в которых должно охватывать весь диапазон концентраций градуировочных характеристик.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемых для контроля градуировочных растворов сохраняется соотношение:
A = \frac{(X - C) \times 100}{C} \leq 10, (1)
где X — концентрация флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена контрольного измерения, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в экстракте контрольных образцов анализируемых матриц, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
20 — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 20%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена, предусмотренных методикой выполнения измерений. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 11.3.
Примечание: в случае, если градуировочная характеристика устанавливается при анализе каждой серии образцов по п. 11.3, контроль стабильности градуировочной характеристики не проводится.
10.4. Подготовка концентрирующих патронов № 1 и проверка хроматографического поведения флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена на них.
10.4.1 Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 1 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см3 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Элюат отбрасывают.
10.4.2. Проверка хроматографического поведения флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена на концентрирующих патронах № 1.
В виалу объемом не менее 20 см3 вносят 1 см3 раствора аналитического стандарта флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в ацетонитриле с концентрацией каждого вещества по 0,1 мкг/см3, прибавляют 10 см3 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле и перемешивают. Приготовленный раствор вносят на подготовленный патрон № 1. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3.
Исходную колбу обмывают тремя порциями по 5 см3 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле и последовательно вносят их на патрон. Элюат после прохождения каждой порции растворителей собирают в отдельные отгонные колбы объемом по 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1 (по объему) и анализируют на содержание флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в условиях хроматографирования по п. 10.4.
Определяют фракции, содержащие флорпирауксифен-бензил и флорпирауксифен, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюентов.
Изучение поведения флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
10.5. Подготовка концентрирующих патронов № 2 и проверка хроматографического поведения флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена на них.
10.5.1 Подготовка концентрирующих патронов № 2 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 2 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см3 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Элюат отбрасывают.
10.5.2. Проверка хроматографического поведения флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена на концентрирующих патронах № 2.
В виалу объемом не менее 20 см3 вносят 1 см3 раствора аналитического стандарта флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в ацетонитриле с концентрацией каждого вещества по 0,1 мкг/см3, прибавляют 10 см3 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле и перемешивают. Приготовленный раствор вносят на подготовленный патрон № 2. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3.
Исходную колбу обмывают тремя порциями по 5 см3 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле и последовательно вносят их на патрон. Элюат после прохождения каждой порции растворителей собирают в отдельные отгонные колбы объемом по 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1 (по объему) и анализируют на содержание флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в условиях хроматографирования по п. 10.4.
Определяют фракции, содержащие флорпирауксифен-бензил и флорпирауксифен, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюентов.
Изучение поведения флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена на концентрирующих патронах № 2 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
10.6. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.
Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют ее при температуре плюс 40 °C в течение 3 — 4 часов, промывая подвижной фазой (смесь компонентов A и B, приготовленных по п. 10.2.1, в соотношении 90:10) при скорости подачи растворителя 0,3 см3/мин.
XI. Проведение измерений
11.1 Зеленая масса кукурузы.
11.1.1 Экстракция.
Образец измельченной зеленой массы кукурузы массой 5 г помещают в плоскодонную стеклянную колбу объемом 100 см3, прибавляют 50 см3 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в мерный цилиндр объемом 50 см3. Объем экстракта доводят до метки 50 см3 раствором 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Экстракт переносят в плоскодонную колбу объемом 100 см3, перемешивают, отбирают аликвоту объемом 10 см3, помещают в отгонную колбу объемом 100 см3 и проводят очистку экстракта на концентрирующих патронах № 1 и 2.
11.1.2 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
Аликвоту экстракта объемом 10 см3, полученную по п. 11.1.1, вносят на подготовленный концентрирующий патрон № 1. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3. Исходную колбу обмывают последовательно двумя порциями по 5 см3 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и также вносят на патрон. Элюаты объединяют с предыдущим в колбе объемом 100 см3 и упаривают до объема 2 — 3 см3 на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.3 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2.
К остатку в колбе, полученному по п. 11.1.2, прибавляют 10 см3 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и вносят на подготовленный концентрирующий патрон № 2. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3. Исходную колбу обмывают последовательно двумя порциями по 5 см3 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и также вносят на патрон. Элюаты объединяют с предыдущим в колбе объемом 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 2,5 см3 смеси ацетонитрила с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1 (по объему) и анализируют на содержание флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в условиях хроматографирования по п. 11.4.
11.2 Зерно кукурузы.
11.2.1 Экстракция.
Образец измельченного зерна кукурузы массой 5 г помещают в плоскодонную стеклянную колбу объемом 100 см3, прибавляют 50 см3 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см3. Экстракцию повторяют еще раз в тех же условиях, используя 50 см3 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле. Экстракт фильтруют и объединяют с предыдущим в отгонной колбе объемом 250 см3 и упаривают до объема 2 — 3 см3 на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.2.2 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
К остатку в колбе, полученному по п. 11.2.1, прибавляют 10 см3 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и вносят на подготовленный концентрирующий патрон № 1. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3. Исходную колбу обмывают последовательно двумя порциями по 5 см3 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и также вносят на патрон. Элюаты объединяют с предыдущим в колбе объемом 100 см3 и упаривают до объема 2 — 3 см3 на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку экстракта как указано в п. 11.1.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2.
Сухой остаток растворяют в 2,5 см3 смеси ацетонитрила с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1 (по объему), фильтруют через шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм и анализируют на содержание флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в условиях хроматографирования по п. 11.4.
11.3 Масло кукурузы.
11.3.1 Экстракция.
Образец масла кукурузы массой 5 г помещают в химический стакан объемом 50 см3, прибавляют 20 см3 гексана, перемешивают и переносят смыв в делительную воронку объемом 250 см3. Химический стакан последовательно обмывают двумя порциями гексана объемом 20 см3 и 10 см3 и все смывы объединяют в делительной воронке объемом 250 см3.
Флорпирауксифен-бензил и флорпирауксифен экстрагируют четырьмя порциями ацетонитрила объемом по 20 см3, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см3. Объединенный экстракт упаривают до объема 2 — 3 см3 на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку экстракта как указано в п. 11.2.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1, п. 11.1.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2.
Сухой остаток растворяют в 2,5 см3 смеси ацетонитрила с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1 (по объему) и анализируют на содержание флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена в условиях хроматографирования по п. 11.4.
11.4 Хроматографические и масс-спектрометрические условия.
11.4.1. Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором типа тройной квадруполь.
11.4.2 Хроматографические условия.
Колонка хроматографическая стальная, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Предколонка хроматографическая стальная, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Температура колонки: плюс 40 °C.
Подвижная фаза: A — 0,1% водный раствор муравьиной кислоты, B — 0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле (% по объему) в градиентном режиме со скоростью потока 0,3 см3/мин.
Градиентный режим потока элюента при определении флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена приведены в табл. 11.1.
Градиентный режим потока элюента при определении флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена
| Время (минуты) | Подвижная фаза A (0,1% водный раствор муравьиной кислоты), % |
Подвижная фаза B (0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле), % |
|---|---|---|
| 0 | 90 | 10 |
| 3 | 0 | 100 |
| 11 | 0 | 100 |
| 12 | 90 | 10 |
| 14 | 90 | 10 |
11.4.2.1 Масс-спектрометрические условия:
Источник ионов — электроспрей.
Газ-осушитель — азот с температурой плюс 320 °C, расход 10 м3/мин.
Расход газа периферийного слоя 11 м3/мин.
Температура газа периферийного слоя 250 °C.
Давление в распылителе 30 psi.
Напряжение на входе в капилляр 4000 В.
Режим ионизации — положительный.
Режим сканирования — мониторинг множественных реакций (MRM).
11.4.2.2 Детектируемые переходы:
Флорпирауксифен: 349 \rightarrow 303 — количественный переход, энергия соударения — 22 В; 349 \rightarrow 268 — качественный переход, энергия соударения — 34 В. Энергия фрагментации 111 В, время сканирования 50 мс, напряжение на ускорителе ячейки 7 В.
Флорпирауксифен-бензил: 439 \rightarrow 91,1 — количественный переход, энергия соударения — 22 В; 439 \rightarrow 65,2 — качественный переход, энергия соударения — 70 В. Энергия фрагментации 110 В, время сканирования 50 мс, напряжение на ускорителе ячейки 7 В.
Образцы, дающие пики больше, чем стандартные растворы флорпирауксифен-бензила и флорпирауксифена с концентрацией 0,25 мкг/см3 (для образцов зеленой массы кукурузы) и 0,12 мкг/см3 (для образцов зерна и масла кукурузы), соответственно разбавляют. В этом случае разбавление учитывают в конечной формуле расчета содержания веществ в пробах.
Примечание. Хроматографические и масс-спектрометрические условия подбираются для каждого индивидуального прибора с масс-спектрометрическим детектированием и могут быть изменены для достижения результатов не хуже вышеуказанных.
XII. Обработка результатов измерения
12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание флорпирауксифен-бензила или флорпирауксифена рассчитывают по формуле без учета полноты извлечения вещества из проб:
X = \frac{A \cdot V \cdot K}{m} , (2)
где X — содержание флорпирауксифен-бензила в пробе, мг/кг;
A — концентрации флорпирауксифен-бензила или флорпирауксифена, соответственно, найденные по градуировочным графикам в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см3;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г;
K — коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа (для зеленой массы K = 5, для зерна и масла кукурузы K = 1).
Для установления уровня содержания флорпирауксифена в перерасчете на флорпирауксифен-бензил, полученное значение содержание флорпирауксифена (X), рассчитанное по формуле, умножают на 1,26 (1,26 — коэффициент пересчета содержания метаболита флорпирауксифена на эквивалент флорпирауксифен-бензила по соотношению молекулярных масс).
Для расчета содержания флорпирауксифен-бензила с учетом его основного метаболита флорпирауксифена суммируют значение содержания флорпирауксифен-бензила (X) и значение содержания флорпирауксифена (в перерасчете на флорпирауксифен-бензил).
XIII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
13.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r, (3)
где X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг или мг/дм3;
r — значение предела повторяемости (табл. 4.1), при этом r = 2,8 \times \sigma_{r} .
При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XIV. Оформление результатов
14.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг, при вероятности P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \delta \cdot \overline{X}/100,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 4.1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«- содержание флорпирауксифен-бензила или флорпирауксифена в зеленой массе кукурузы — менее 0,05 мг/кг;»
- содержание флорпирауксифен-бензила или флорпирауксифена в зерне и масле кукурузы — менее 0,005 мг/кг».
XV. Контроль качества результатов измерений
15.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6).
Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ФЛОРПИРАУКСИФЕН-БЕНЗИЛА И ФЛОРПИРАУКСИФЕНА ИЗ ОБРАЗЦОВ ЗЕЛЕНОЙ МАССЫ, ЗЕРНА И МАСЛА КУКУРУЗЫ (5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, P = 0,95)
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. ГОСТ Р 8.563 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений».
3. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6) «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
4. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
5. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
6. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
7. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
8. ГОСТ 12.4.009 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
9. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
10. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
11. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
12. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
13. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
14. ГОСТ Р 58144 «Вода дистиллированная. Технические условия».
15. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
16. ГОСТ 5556 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».
17. ГОСТ 22967 «Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний».
18. ГОСТ 9293 «Азот газообразный и жидкий. Технические условия».
19. ГОСТ 2603 «Реактивы. Ацетон. Технические условия».
20. ГОСТ 20490 «Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия».
21. ГОСТ 4166 «Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия».
22. ГОСТ ISO 6497 «Корма. Отбор проб».
23. ГОСТ 13586.3 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб».
24. ГОСТ 13634 «Кукуруза. Требования при заготовках и поставках».
25. ГОСТ Р 53903 «Кукуруза кормовая. Технические условия».
26. ГОСТ 32190 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб».
27. ГОСТ 8808 «Масло кукурузное. Технические условия».