МУК 4.1.3924-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств бензовиндифлупира в кофе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 03.07.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 03.10.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 3 июля 2023 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ БЕНЗОВИНДИФЛУПИРА В КОФЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3924-23
Дата введения 3 октября 2023 года
1. Разработаны ФБУН «Федеральный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (Кузьмин С.В., Федорова Н.Е., Бондарева Л.Г.).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 3 июля 2023 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) для определения массовой концентрации бензовиндифлупира в кофе в диапазонах 0,01 — 0,2 мг/кг без учета разбавления и при разбавлении в 50 раз — 0,01 — 10 мг/кг.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические свойства
2.1. Бензовиндифлупир. N-[(1RS,4SR)-9-дихлорметилен)-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-метаннафтален-5-ил]-3-дифторметил)-1-(метилпиразол)-4-карбоксамид <1>.
<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).
Брутто-формула — C18H15C12F2N3O. Молекулярная масса 398,2.
2.2. Физические и химические свойства: белый порошок без запаха. Температура плавления плюс (148,4 +/- 0,5) °C. Плотность 1,466. Давление паров — менее 3,2 x 109 Па (плюс 25 °C). Растворимость в органических растворителях (при плюс 25 °C, в г/дм3): ацетон — 350, дихлорметан — 450, метанол — 76, гексан — 270, октанол — 19, этилацетат — 190, толуол — 48. Растворимость в воде при плюс 25 °C и pH 6,7 — 7,5 — 0,98 мг/дм3. Коэффициент распределения в системе н-октанол — вода KowlogP = 4,3 +/- 0,3 (плюс 25 °C, pH 6,59). Гидролитически стабилен в стерильном буфере в темноте при pH 4, 5 и 9 до 5-ти дней (плюс 50 °C).
Бензовиндифлупир — фунгицид широкого спектра действия, принадлежащий к химическому классу пиразолкарбоксамидов.
III. Погрешность измерений
3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические характеристики
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (границы относительной погрешности, P = 0,95), \pm \delta , % | Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), \sigma_{r} , % | Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), \sigma_{R} , % | Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений) r, % | Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), R, % (P = 0,95) |
| Кофе | 0,01 — 10,00 | 50 | 4,7 | 6,6 | 13 | 19 |
| Примечание. Диапазон определяемых концентраций, указанный в табл. 3.1, приведен с учетом разбавления образца в 50 раз. | ||||||
IV. Метод измерений
4.1. Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором.
4.2. Уровень бензовиндифлупира в кофе определяют после извлечения вещества из анализируемых образцов зерен кофе смесью ацетонитрила с водой (80:20 по объему), очистки и концентрирования на картридже, заполненном сорбционным материалом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола. Элюирование бензовиндифлупира проводят метанолом.
4.3. Нижний предел измерения бензовиндифлупира в анализируемом объеме пробы — 1 нг.
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, термостатом колонки | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Прибор/приборы для измерения атмосферного давления, температуры и относительной влажности воздуха | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Весы лабораторные аналитические | Предел допустимой погрешности 0,0005 г, ГОСТ Р 53228 |
| Весы лабораторные | Наибольший предел взвешивания 420 г, предел допустимой погрешности +/- 0,01 г, ГОСТ Р 53228 |
| Меры массы | ГОСТ OIML R 111-1 |
| Цилиндры мерные | Вместимостью 25, 100, 500 и 1000 см3. Исполнение 1-4; 1(2-4)-25-2; 1(2-4)-100-2; 1(2-4)-500-2 и 1(2-4)-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Колбы мерные | Вместимостью 25, 100, 500 и 1000 см3 типа 2-25-2, 2-100-2, 2-500-2 и 2-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Весы аналитические | Предел допустимой погрешности 0,001 г по ГОСТ Р 53228 |
| Пипетки градуированные | Вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 типа 1-1(2)-2-1, 1-1(2)-2-2, 1-1(2)-2-5 и 1-1(2)-2-10 по ГОСТ 29227 |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Бензовиндифлупир | Аналитический стандарт с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Ацетонитрил | Квалификация не ниже «суперградиент для ВЭЖХ» |
| Вода для лабораторного анализа | Бидистиллированная, деионизованная по ГОСТ Р 52501 |
| Калий углекислый (карбонат калия, поташ) | Химически чистый, прокаленный по ГОСТ 4221 |
| Метиловый спирт (метанол) | Химически чистый по ГОСТ 6995 |
| Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид фосфора) | Квалификация не ниже «химически чистый» |
Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующей дополнительной очистки растворителей.
Вспомогательные устройства, материалы
| Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Баня ультразвуковая | Рабочая частота 35 кГц |
| Воронки химические конусные | Диаметром 40 — 45 мм, ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | - |
| Измельчитель бытовой | - |
| Набор для фильтрации растворителей через мембрану | - |
| Установка для перегонки растворителей при атмосферном давлении | - |
| Холодильник/морозильник бытовой | - |
| Хроматографическая колонка стальная | Длина 250 мм, внутренний диаметр 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми алкильными группами C-8 или C-18, зернением 5 мкм |
| Картридж для твердофазной экстракции | Содержащий пористый сорбент (60 мг) на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола, с размером частиц 30 — 60 мкм и размером пор 80 — 82Е |
| Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работ с концентрирующими патронами-картриджами) | - |
| Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом | Обеспечивающим вакуум до 10 мбар |
| Аппарат для встряхивания или орбитальный шейкер | Диапазон регулировки оборотов 50 — 200 об/мин, орбита до 10 мм |
| Ректификационная колонна | Содержащая число теоретических тарелок не менее 30 |
| Груша резиновая | - |
| Насос водоструйный вакуумный | - |
| Бумажные фильтры низкой плотности, обеззоленные (фильтры) Изготовлены из бумаги фильтровальной быстрой фильтрации ФБ-П, ГОСТ 12076 | |
| Мембраны микропористые капроновые на шприц | Размер пор мембраны — 0,2 мкм |
| Шприцы медицинские одноразовые | Вместимостью 2 — 5 см3 по ГОСТ ISO 7886-1 |
| Пробирки | П-1-15, вместимостью 15 см3 по ГОСТ 1770 |
| Манифолд в комплекте с вакуумным насосом (для работ с патроном для твердофазной экстракции) | - |
| Колбы круглодонные (для упаривания) | На шлифе вместимостью 50 и 250 см3, ГОСТ 25336, типы К и Гр |
| Виалы хроматографические стеклянные | Вместимость 2 см3 с септой с фторопластовым покрытием |
| Колбы конические плоскодонные | На шлифе вместимостью 250 — 300 см3, ГОСТ 25336 |
| Воронка Бюхнера | С перегородкой, 80 x 130 мм, ГОСТ 9147 |
| Колба Бунзена | 1-500 ТС, ГОСТ 25336-82 |
| Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VII. Условия измерений
7.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (15 — 30) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
VIII. Подготовка к выполнению измерений
8.1 Очистка растворителей.
Ацетонитрил. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм3 ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм3 ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.
8.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 750 см3 ацетонитрила и 250 см3 бидистиллированной или деионизованной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют. Подвижную фазу хранят не более 30 дней.
8.3. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ. Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 8.2) при скорости подачи растворителя 1,0 см3/мин до установления стабильной базовой линии.
8.4 Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.
8.4.1. Исходный раствор бензовиндифлупира для градуировки (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,0100 +/- 0,0005) г бензовиндифлупира, добавляют 50 — 70 см3 ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится в холодильнике (плюс 2 — 6 °C) не более 9 месяцев.
Растворы № 1 — 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.
8.4.2. Раствор № 1 бензовиндифлупира для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см3).
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10 см3 исходного раствора бензовиндифлупира (п. 8.4.1) с концентрацией 100 мкг/см3, разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор № 1 хранится в холодильнике (плюс 2 — 6 °C) не более 6 месяцев.
8.4.3. Рабочие растворы № 2 — 6 бензовиндифлупира для градуировки (концентрация 0,05 — 1,0 мкг/см3). В 5 мерных колб вместимостью 100 см3 помещают 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; и 10,0 см3 рабочего раствора № 1 с концентрацией 10,0 мкг/см3 (п. 8.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 6 с концентрациями бензовиндифлупира 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1,0 мкг/см3.
Растворы готовят при температуре плюс (20 — 25) °C, хранят в холодильнике при температуре плюс (4 — 6) °C не более трех месяцев.
8.5. Установление градуировочной характеристики. Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации бензовиндифлупира в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки.
В инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных ниже. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков бензовиндифлупира, на основании которых строят градуировочную зависимость.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят анализ не менее двух образцов растворов для градуировки, содержание бензовиндифлупира в которых должно входить в диапазон концентраций от 0,05 до 1,00 мкг/см3. Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
A = | \frac{(X - C)}{C} | \cdot 100 \leq B, (1)
где X — концентрация бензовиндифлупира в пробе при контрольном измерении, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора бензовиндифлупира, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
B — норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).
8.6 Приготовление смесей органических растворителей для экстракции.
8.6.1. Смесь ацетонитрил-вода = 8:2. В мерную колбу на 500 см3 вносят 400 см3 ацетонитрила и 100 см3 бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают. Экстракционная смесь хранится при комнатной температуре не более 2-х недель.
8.6.2. Смесь ацетонитрил-вода = 2:8. В мерную колбу на 500 см3 вносят 100 см3 ацетонитрила и 400 см3 бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают. Экстракционная смесь хранится при комнатной температуре не более 2-х недель.
8.7. Подготовка картриджа для очистки и концентрирования. Картридж устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума. Промывают картридж последовательно 1 см3 метанола, 1 см3 ацетонитрила, затем три раза по 1 см3 смесью ацетонитрил-вода, в соотношении 2:8 по объему, приготовленной по п. 8.6.2. Процедуру проводят с использованием вакуума. Скорость элюирования — 15 — 20 капель в минуту. При работе следует не допускать высыхания верхнего слоя сорбента в картридже.
IX. Отбор и условия хранения проб
9.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <2>.
<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79; ГОСТ ISO 4072 «Межгосударственный стандарт. Кофе зеленый в мешках. Отбор проб».
Пробы зерен кофе подсушивают и хранят при комнатной температуре не более 2 недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.
X. Выполнение определения
10.1. Образец измельченных зерен кофе (10 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 — 300 см3, затем добавляют 100 см3 смеси ацетонитрил-вода, приготовленной в соответствии с п. 8.6.1, перемешивают. Оставляют в покое на 15 минут. После чего колбу со смесью помещают на встряхиватель и продолжают экстракцию в течение 30 минут. После встряхивания смесь фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разрежения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр низкой плотности. Образец повторно экстрагируют 50 см3 смеси ацетонитрил-вода, приготовленной в соответствии с п. 8.6.1, на ультразвуковой ванне в течение 15 минут, раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Фильтраты объединяются и переносятся в круглодонную колбу объемом 250 см3. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 30 °C до водного остатка (15 — 20 см3). Водный остаток пропускают через подготовленный в соответствии с п. 8.7 картридж со скоростью 15 — 20 капель в минуту, используя разрежение, создаваемое водоструйным насосом. После пропускания пробы картридж четыре раза по 1 см3 промывают смесью ацетонитрил-вода в соотношением 2:8, приготовленной в соответствии с п. 8.6.2. Бензовиндифлупир элюируют с картриджа метанолом 2 раза по 1 см3. Элюат собирают в круглодонную колбу объемом 50 см3. Упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 30 °C до влажного остатка. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 2 см3 подвижной фазы, приготовленной в соответствии с п. 8.2.2. Перед хроматографированием пробу дополнительно фильтруют через мембранный фильтр.
10.2 Условия хроматографирования. Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:
- жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором и термостатом колонки;
- хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми алкильными группами (C-18 или C-8) для удерживания гидрофильных соединений, зернением 5 мкм;
- рабочая длина волны: 254 нм;
- температура колонки: плюс 25 °C;
- подвижная фаза: ацетонитрил — деионизованная вода (75:25, по объему);
- скорость потока элюента: 1,0 см3/мин;
- объем вводимой пробы: 20 мм3;
- линейный диапазон детектирования: 1 — 20 нг.
Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор бензовиндифлупира с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют смесью ацетонитрил — деионизированная вода (75:25 по объему), приготовленной в соответствии с п. 8.2, не более чем в 50 раз.
XI. Обработка результатов анализа
11.1 Содержание бензовиндифлупира в пробах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:
где V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г;
C — концентрация бензовиндифлупира, найденная по градуировочному графику в соответствии с площадью хроматографического пика, мкг/см3;
Кр — кратность разбавления (если экстракт подвергался разбавлению).
Примечание. Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.
XII. Оформление результатов измерений
12.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг, при вероятности P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг.
\Delta = \delta \cdot X/100, (3)
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.
Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «Содержание бензовиндифлупира в кофе — менее 0,01 мг/кг» <3>.
<3> 0,01 мг/кг — предел обнаружения бензовиндифлупира в кофе.
XIII. Контроль качества результатов измерений
13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6). Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6) «Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
3. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
4. ГОСТ OIML R 111-1 «Межгосударственный стандарт. Государственная система обеспечения единства измерений. Гири классов E1, E2, F1, F2, M1, M1-2, M2, M2-3 и M3. Часть 1. Метрологические и технические требования».
5. ГОСТ 29227 «Межгосударственный стандарт. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
6. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
7. ГОСТ 6995 «Государственный стандарт Союза ССР. Метанол-яд. Технические условия».
8. ГОСТ 25336 «Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
9. ГОСТ 12.1.004 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
10. ГОСТ 12.1.007 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
11. ГОСТ 12.1.018 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования».
12. ГОСТ 12.1.019 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
13. ГОСТ 12.4.009 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
14. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) «Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
15. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79.
16. ГОСТ ISO 4072 «Межгосударственный стандарт. Кофе зеленый в мешках. Отбор проб».
17. ГОСТ 12026 «Межгосударственный стандарт. Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия».