МУК 4.1.3904-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств оксатиапипролина в семенах масличных культур и растительных маслах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 29.06.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 29.09.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 июня 2023 года
Дата введения 29 сентября 2023 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ОКСАТИАПИПРОЛИНА В СЕМЕНАХ МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР И РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЛАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3904-23
Разработаны ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр „Агроэкология пестицидов и агрохимикатов“ Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, О.И. Рыбакова, Е.Н. Тестова, П.В. Рязанцев).»
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 июня 2023 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим детектированием для определения уровня остаточных количеств оксатиапипролина в семенах масличных культур и растительных маслах в диапазоне 0,01 — 0,10 мг/кг.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические свойства
2.1 Физико-химические свойства оксатиапипролина.
Название вещества по ИЮПАК: 1-(4-{4-[(5RS)-5-(2,6-дифторфенил)-4,5-дигидро-1,2-оксазол-3-ил]-1,3-тиазол-2-ил}-1-пиперидил)-2-[5-метил-3-(трифтор-метил)-1H-пиразол-1-ил]этанон.
Эмпирическая формула: C24H22F5N5O2S.
Агрегатное состояние: порошок.
Цвет, запах: белого цвета, без запаха.
Давление паров: 1,41 x 10-3 мПа.
Коэффициент распределения октанол/вода (при pH 7, плюс 20 °C): KowlogP = 3,66.
Температура плавления: плюс 146,4 °C.
Растворимость в воде (мг/дм3, при плюс 20 °C): 0,1749.
Растворимость в органических растворителях (г/дм3, при плюс 20 °C): хлористый метилен — 352; ацетон — 147; ацетонитрил — 111; этилацетат — 31,7; метанол — 13; толуол — 5,7; н-октанол — 0,04; гексан — 0,01.
Гидролитически стабилен при pH 7 и температуре плюс 20 °C.
Устойчив в почве ДТ50 121 день.
2.2. Оксатиапипролин относится веществам малоопасным по острой оральной (ЛД50 для крыс более 5000 мг/кг), дермальной токсичности (ЛД50 для крыс более 5000 мг/кг) и ингаляционной токсичности (ЛК50 для крыс (4 часа) более 5000 мг/м3 воздуха). Не раздражает слизистую глаз и кожу.
2.3. Оксатиапипролин — фунгицид системного действия. Ингибирует оксистеролсвязывающий белок, который предотвращает прорастание споры и ингибирует образование зародышевой трубки и рост мицелия.
III. Метод измерения
3.1. Метод основан на определении оксатиапипролина с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе с использованием тандемного масс-спектрометрического детектора (далее — ВЭЖХ-МС-МС).
Определение оксатиапипролина в семенах подсолнечника проводится после его экстракции из образцов подкисленным ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах с гидрофильным слабокислым сорбентом (C-силикагель).
Определение оксатиапипролина в масле подсолнечника проводится после его экстракции из растворенных в гексане образцов ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах с гидрофильным слабокислым сорбентом (C-силикагель).
Идентификация оксатиапипролина проводится по времени удерживания, наличию характеристичных фрагментарных ионов и соотношению интенсивностей (площадей) пиков этих ионов. Количественное определение оксатиапипролина проводится методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность метода достигается за счет использования масс-спектрометрического детектора.
IV. Метрологические характеристики
4.1. При соблюдении всех условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 4.1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические характеристики
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 4.2 и приложении к настоящим МУК.
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для оксатиапипролина
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1 Средства измерений:
- весы аналитические класса точности по ГОСТ Р 53228 — специальный (I) с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г;
- весы лабораторные общего назначения класса точности по ГОСТ Р 53228 — средний (III) с наибольшим пределом взвешивания до 400 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,5 г;
- колбы мерные на 10, 100, 250, 500 и 1000 см3, ГОСТ 1770;
- пипетки мерные на 1,0; 2,0, 5,0 и 10,0 см3, ГОСТ 29227;
- цилиндры мерные на 10, 25, 50, 100, 250, 500 и 1000 см3, ГОСТ 1770;
- система высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектором, включающая модульный жидкостной хроматограф, состоящий из градиентного насоса на два растворителя, позволяющий регулировать поток элюента от 0,001 до 5,0 см3/мин и создавать давление от 0 до 600 бар; вакуумного дегазатора; термостата колонок с двумя независимо нагреваемыми зонами с диапазоном температур от плюс 10 до плюс 80 °C и с возможностью использования стандартного автосамплера с дозирующим объемом от 0,1 до 100 мм3 для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему. ВЭЖХ система соединена с тандемным масс-спектрометрическим детектором типа тройной квадруполь с двумя высокопроизводительными турбомолекулярными насосами, позволяющим регистрировать отдельные ионы с заданными массами от 50 до 3000 а.е.м.
- система оснащена компьютерной системой обработки данных, контролирующей работу всего прибора, обеспечивающей сбор и хранение всех масс-хроматограмм в процессе проведения хромато-масс-спектрометрического анализа, обработку результатов измерений, вывод и расчет масс-хроматограмм и количественный анализ.
5.2 Реактивы:
- оксатиапипролин, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 98,9%;
- азот, особой чистоты, ГОСТ 9293;
- ацетон, химически чистый;
- ацетонитрил, особой чистоты, УФ-200 нм;
- вода дистиллированная по ГОСТ 6709 и (или) бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости);
- n-Гексан, химически чистый;
- калий марганцовокислый, чистый для анализа, ГОСТ 20490;
- кальций хлористый, чистый;
- кислота муравьиная, чистая для анализа, ГОСТ 5848;
- концентрирующие патроны для твердофазной экстракции с гидрофобным слабокислым сорбентом с постоянной активностью с размером частиц 63 — 200 мкм (C-силикагель) (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г), (патрон № 1);
- спирт метиловый (метанол), химически чистый, ГОСТ 6995.
4.3 Вспомогательные устройства, материалы:
- алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами — ГОСТ 25336;
- аппарат для встряхивания проб с возвратно-поступательным направлением колебаний, с максимальной загрузкой 10 кг, с амплитудой колебаний 30 мм и скоростью от 10 до 300 колебаний в минуту;
- банки полипропиленовые с крышками для экстракции вместимостью 250 см3;
- ванна ультразвуковая с потребляемой мощностью 140 Вт, рабочей частотой 50 Гц, рабочим объемом 4,5 дм3;
- виалы объемом 2 см3, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, прокалываемой микрошприцем для автоматического дозатора проб;
- виалы с тефлоновыми прокладками, стеклянные, объемом не менее 20 см3;
- воронки делительные на 250 и 500 см3, ГОСТ 25336;
- воронки лабораторные, стеклянные, ГОСТ 25336;
- испаритель ротационный вакуумный с ручным подъемником, с диагональным конденсором и объемом испарительной колбы от 50 до 3000 см3, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об/мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом 5 дм3 и с диапазоном температур от плюс 20 до плюс 100 °C;
- колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1000 см3, ГОСТ 25336;
- колбы круглодонные со шлифом объемом 100, 250 см3 и 4000 см3 ТС;
- колонка хроматографическая стальная длиной 150 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 3,5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18;
- насос диафрагменный химически стойкий на 100%, с мощностью электропривода 245 Вт, предельным вакуумом 100 мбар/абс, с избыточным давлением 1 бар и скоростью откачки 34 дм3/мин;
- предколонка хроматографическая стальная длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18;
- стаканы стеклянные термостойкие объемом 100 — 1000 см3, ГОСТ 25336;
- установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4000 см3 и приемной конической колбой объемом 1000 см3;
- фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие, диаметром 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г;
- фильтры мембранные для очистки растворителей, диаметром 47 мм с отверстиями пор 0,45 мкм;
- шприц инъекционный многократного применения объемом 10 см3, ГОСТ 22967.
Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам, а также посуды, реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
VII. Квалификация операторов
7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на газовом хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VIII. Отбор проб
8.1. Отбор проб производится в соответствии с правилами <1>.
<1> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79.
Пробы зерна кукурузы и семян масличных культур подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света и хранят в бумажной или тканевой упаковке в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Пробы растительного масла хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 10 суток.
IX. Условия проведения измерений
9.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
X. Подготовка к определению
10.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик.
Подготовка органических растворителей.
10.1.1 Очистка ацетонитрила.
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре плюс 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 81,5 °C, отбрасывают.
10.1.2 Приготовление бидистиллированной воды.
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3 и кипятят в течение 6 часов.
Собирают фракции, отогнанные при температуре плюс 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 100,0 °C, отбрасывают.
10.2 Приготовление растворов для проведения анализа.
10.2.1 Приготовление рабочих растворов.
10.2.1.1. Приготовление 1,0%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле.
В мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 500 см3 ацетонитрила, прибавляют 10,0 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки ацетонитрилом.
10.2.1.2 Приготовление 0,05%-го водного раствора муравьиной кислоты.
В мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 500 см3 бидистиллированной воды, прибавляют 0,5 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки бидистиллированной водой. Раствор используется как компонент подвижной фазы.
10.2.1.3. Приготовление 0,01%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле В мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 500 см3 метанола, прибавляют 0,1 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки метанолом. Раствор используется как компонент подвижной фазы.
10.2.2 Приготовление градуировочных растворов.
Стандартный раствор с концентрацией оксатиапипролина 100,0 мкг/см3 в ацетонитриле стабилен при хранении при температуре не выше минус 18 °C в течение 6 месяцев.
Все стандартные растворы, приготовленные в ацетонитриле или в растворе 0,15%-м муравьиной кислоты в ацетонитриле, остаются стабильными в течение 3 месяцев при хранении при температуре не выше минус 18 °C.
Стандартные растворы следует помещать в морозильную камеру непосредственно после каждого использования.
10.2.2.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией оксатиапипролина 100,0 мкг/см3.
Взвешивают 10 мг оксатиапипролина в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Полученный стандартный раствор № 1 используют для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики.
10.2.2.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией оксатиапипролина 10,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1,0 см3 и помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор № 2 используют для приготовления градуировочных растворов и стандартных растворов для внесения в контрольные образцы.
10.2.2.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией оксатиапипролина 1,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1,0 см3 и помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Доводят объем до метки 0,1%-м раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле при перемешивании. Стандартный раствор № 3 используют для приготовления градуировочных растворов.
10.2.2.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией оксатиапипролина 0,1 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1,0 см3 и помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Доводят объем до метки 0,1%-м раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле при перемешивании. Стандартный раствор № 4 используют для приготовления градуировочных растворов.
10.2.2.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией оксатиапипролина 0,025 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 2,5 см3 и помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Доводят объем до метки 0,1%-м раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле при перемешивании. Стандартный раствор № 5 используют для установления градуировочной характеристики.
10.2.2.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией оксатиапипролина 0,02 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 2,0 см3 и помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Доводят объем до метки 0,1%-м раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле при перемешивании. Стандартный раствор № 5 используют для установления градуировочной характеристики.
10.2.2.7. Стандартный раствор № 7 с концентрацией оксатиапипролина 0,01 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 1,0 см3 и помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Доводят объем до метки 0,1%-м раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле при перемешивании. Стандартный раствор № 7 используют для установления градуировочной характеристики.
10.2.2.8. Стандартный раствор № 8 с концентрацией оксатиапипролина 0,005 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 7 отбирают пипеткой 5,0 см3 и помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Доводят объем до метки 0,1%-м раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле при перемешивании. Стандартный раствор № 8 используют для установления градуировочной характеристики.
10.2.2.9. Стандартный раствор № 9 с концентрацией оксатиапипролина 0,002 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 6 отбирают пипеткой 1,0 см3 и помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Доводят объем до метки 0,1%-м раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле при перемешивании. Стандартный раствор № 9 используют для установления градуировочной характеристики.
10.2.1.10. Стандартный раствор № 10 с концентрацией оксатиапипролина 0,0014 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 9 отбирают пипеткой 7,0 см3 и помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Доводят объем до метки 0,1%-м раствором муравьиной кислоты в ацетонитриле при перемешивании. Стандартный раствор № 10 используют для установления градуировочной характеристики.
10.2.2.11. Стандартные растворы оксатиапипролина с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы и для проверки хроматографического поведения на концентрирующих патронах.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 оксатиапипролина и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы семян подсолнечника.
Методом последовательного разведения ацетоном стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 оксатиапипролина и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы масла подсолнечника.
Для проверки хроматографического поведения на концентрирующих патронах используется стандартный раствор оксатиапипролина с концентрацией 0,1 мкг/см3, полученный путем последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора № 2.
10.3 Установление градуировочной характеристики.
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость отклика фрагментарного иона, используемого для количественного определения, от концентрации оксатиапипролина в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 6-ти растворам для градуировки с концентрацией 0,0014; 0,0020; 0,0050; 0,0100; 0,0200 и 0,0250 мкг/см3.
В инжектор хроматографа вводят по 10 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3. Осуществляют не менее 5-ти параллельных измерений.
Производят расчет параметров градуировочной характеристики (при помощи программного обеспечения): формулы зависимости отклика фрагментарного иона от концентрации оксатиапипролина в растворе, коэффициента корреляции, который должен быть не менее 0,995, и регрессионных остатков, которые не должны превышать 20% для каждого уровня градуировочной характеристики.
Если линейность градуировочной характеристики была продемонстрирована, то при анализе серий образцов допускается устанавливать градуировочную характеристику методом абсолютной калибровки при однократном измерении по 5-ти и более уровням концентраций, охватывающим весь диапазон измерений. Данные для построения градуировочной зависимости набираются перед началом серии анализов и после ее окончания. По полученным данным производят расчет параметров градуировочной характеристики. Рекомендуется в серию анализов включать не более 12 инъекций.
10.4. Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения оксатиапипролина на них.
10.4.1 Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см3 гексана. Элюат отбрасывают.
Не допускать высыхания поверхности патрона.
10.4.2. Проверка хроматографического поведения оксатиапипролина на концентрирующих патронах № 1.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора оксатиапипролина в ацетонитриле с концентрацией 0,1 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 10 см3 гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 10 см3 смеси 0,2%-го муравьиной кислоты в ацетонитриле и 10 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Исходную колбу обмывают 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, обмывают стенки колбы и вносят на патрон. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 10 см3 смеси 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и 10 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Вносят на патрон последовательно две порции смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1 объемом по 10 см3 каждая. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные отгонные колбы объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Сухой остаток растворяют в 10 см3 смеси 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и 10 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие оксатиапипролин, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения оксатиапипролина на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
10.5. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.
Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографической системы и стабилизируют при температуре плюс 40 °C 3 — 4 часа.
XI. Проведение измерений
11.1 Семена подсолнечника.
11.1.1. Экстракция и очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Образец измельченных семян подсолнечника массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 30 см3 1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в делительную воронку объемом 250 см3 через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще двумя порциями по 30 см3 1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле каждая в тех же условиях. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке объемом 250 см3.
К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке прибавляют 50 см3 гексана и интенсивно встряхивают делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный собирают в отгонную колбу объемом 250 см3, верхний слой (гексановый) отбрасывают.
Ацетонитрильный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C.
Остатки кислоты отдувают током холодного воздуха.
11.1.2 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
Сухой остаток, полученный по п. 10.1.1, растворяют в 10 см3 гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат отбрасывают.
Исходный колбу обмывают 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
Оксатиапипролин элюируют с патрона 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют методом последовательного разбавления в 50 см3 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле. Для этого сухой остаток растворяют в 5 см3 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле, отбирают 1 см3 экстракта, переносят в виалу объемом 20 см3, прибавляют туда же 9 см3 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и перемешивают. Пробу переносят в виалу объемом 2 см3 для автоматического дозатора проб и 10 мм3 вводят в хроматограф.
11.2 Масло подсолнечника.
10.2.1. Экстракция и очистка полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Образец масла подсолнечника массой 10 г помещают в химический стакан объемом 100 см3, прибавляют 20 см3 гексана, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см3. Химический стакан обмывают последовательно еще двумя порциями гексана объемом по 20 см3 и 10 см3 и объединяют с первым смывом в делительной воронке объемом 250 см3.
Химический стакан обмывают 20 см3 ацетонитрила, переносят в делительную воронку с гексановым экстрактом и интенсивно встряхивают 2 минуты. После разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в чистый химический стакан объемом 100 см3. Оксатиапипролин экстрагируют еще двумя порциями ацетонитрила объемом по 20 см3 каждая, встряхивая делительную воронку 2 минуты. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой собирают в чистый химический стакан объемом 100 см3, объединяя все ацетонитрильные экстракты.
Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку, прибавляют туда 50 см3 гексана и интенсивно встряхивают делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный собирают в отгонную колбу объемом 250 см3, верхний слой (гексановый) отбрасывают.
Ацетонитрильный экстракт упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку экстракта по п. 11.1.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
Сухой остаток растворяют методом последовательного разбавления в 50 см3 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле. Для этого сухой остаток растворяют сначала в 5 см3 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле, отбирают 1 см3 экстракта, переносят в виалу объемом 20 см3, прибавляют туда же 9 см3 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле и перемешивают. Пробу переносят в виалу объемом 2 см3 для автоматического дозатора проб и 10 мм3 вводят в хроматограф.
11.3 Хроматографические и масс-спектрометрические условия.
11.3.1 Система высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектором, включающая:
- модульный жидкостной хроматограф, состоящий из градиентного насоса на два растворителя, позволяющий регулировать поток элюента от 0,001 до 5,0 см3/мин и создавать давление от 0 до 600 бар; вакуумного дегазатора; термостата колонок с двумя независимо нагреваемыми зонами с диапазоном температур от плюс 10 до плюс 80 °C; автоматического дозатора проб с использованием виал объемом 2 см3;
- ВЭЖХ система соединена с тандемным масс-спектрометрическим детектором типа тройная квадруполь с двумя высокопроизводительными турбомолекулярными насосами, позволяющим регистрировать отдельные ионы с заданными массами от 5 до 3000 а.е.м.;
- система оснащена компьютерной системой обработки данных, контролирующей работу всего прибора, обеспечивающей сбор и хранение всех масс-хроматограмм в процессе проведения хромато-масс-спектрометрического анализа, обработку результатов измерений, вывод и расчет масс-хроматограмм и количественный анализ.
11.3.2 Хроматографические условия.
Колонка хроматографическая стальная длиной 100 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 3,5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Предколонка хроматографическая стальная длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Температура колонки: плюс 40 °C.
Подвижная фаза: A — 0,05% водный раствор муравьиной кислоты, B — 0,01%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле (% по объему) в градиентном режиме со скоростью потока 0,6 см3/мин (табл. 11.1).
Градиентный режим потока элюента при определении оксатиапипролина
| Время (минуты) |
A: 0,05%-й водный раствор муравьиной кислоты |
B: 0,01%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле |
|---|---|---|
| 0 | 70 | 30 |
| 4 | 40 | 60 |
| 5 | 30 | 70 |
| 10 | 20 | 80 |
| 10,2 | 1 | 99 |
| 14 | 1 | 99 |
| 15 | 70 | 30 |
| 18 | 70 | 30 |
Для направления потока в слив до и после десорбции оксатиапипролина используется шестипортовый переключающий кран с электроприводом, входящий в состав системы. Режим переключения шестипортового крана: с 0 до 8 минут — в слив; с 8 до 13 минуты — в источник масс-детектора; с 13 до 18 минуты — в слив.
11.3.3 Масс-спектрометрические условия
Время подачи элюента во время анализа: 8 — 13 минут.
Газ-осушитель — азот с температурой плюс 320 °C, расход 10 м3/мин.
Расход газа периферийного слоя 11 м3/мин с температурой плюс 400 °C.
Давление в распылителе 30 psi.
Источник ионов — электроспрей.
Режим ионизации — положительный.
Режим сканирования — мониторинг множественных реакций (MRM).
- оксатиапипролин: 540 \rightarrow 500 — количественный переход, энергия соударения — 35 В; 540 \rightarrow 167 — качественный переход, энергия соударения — 38 В. Энергия фрагментации 130 В, время сканирования 50 мс, напряжение на ускорителе ячейки 5 В.
Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор оксатиапипролина с концентрацией 0,025 мкг/см3, соответственно разбавляют.
XII. Обработка результатов измерения
12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание оксатиапипролина в пробах рассчитывают по формуле, без учета полноты извлечения вещества из проб (1):
X = \frac{S_{\text{пр}} \cdot A \cdot V}{100 \cdot S_{\text{ст}} \cdot m} \cdot P , (1)
где X — содержание оксатиапипролина в пробе, мг/кг;
Sст — высота (площадь) пика стандарта, мм;
Sпр — высота (площадь) пика образца, мм;
A — концентрация стандартного раствора, мкг/см3;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г;
P — содержание оксатиапипролина в аналитическом стандарте, %.
XIII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
13.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (2):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , (2)
где X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг или мг/дм3;
r — значение предела повторяемости (табл. 4.1), при этом r = 2,8 \times \sigma_{r} .
При невыполнении условия (2) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XIV. Оформление результатов
14.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где
\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} , где
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 4.1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«- при определении остаточного количества оксатиапипролина в семенах масличных культур и в растительных маслах содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг».
Примечание. 0,01 мг/кг — предел обнаружения определяемой концентрации оксатиапипролина в семенах масличных культур и в растительных маслах.
XV. Контроль качества результатов измерений
15.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляются в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6.
Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание оксатиапипролина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций градуировочных характеристик.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение (3):
A = \frac{|X - C| \cdot 100}{C} \leq 20 , (3)
X — концентрация оксатиапипролина контрольного измерения, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора оксатиапипролина в 0,1%-м растворе муравьиной кислоты в ацетонитриле, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
20 — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 20%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов оксатиапипролина, предусмотренных методикой выполнения измерений. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 10.3.
Примечание. В случае, если градуировочная характеристика устанавливается при анализе каждой серии образцов по п. 10.3, контроль стабильности градуировочной характеристики не проводится.
15.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки Cд должна удовлетворять условию (4):
C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime} , (4)
где \pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta ,
где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 4.1), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
\text{К}_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - C_{\text{д}} ,
где \overline{X}\prime , \overline{X} , Cд, — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 13.1), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}}
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию (5):
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (5) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (5) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
15.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , (6)
где X1, X2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 4.1), %.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ОКСАТИАПИПРОЛИНА ИЗ ОБРАЗЦОВ СЕМЯН И МАСЛА ПОДСОЛНЕЧНИКА (5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, P = 0,95)
Библиографические ссылки
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. ГОСТ Р 8.563 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений».
3. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6) «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
4. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
5. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
6. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
7. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
8. ГОСТ 12.4.009 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
9. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
10. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
11. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
12. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
13. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
14. ГОСТ 6709 «Вода дистиллированная. Технические условия».
15. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
16. ГОСТ 5556 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».
17. ГОСТ 9293 «Азот газообразный и жидкий. Технические условия».
18. ГОСТ 2603 «Реактивы. Ацетон. Технические условия»
19. ГОСТ 20490 «Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия».
20. ГОСТ 4166 «Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия».
21. ГОСТ 4201 «Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия».
22. ГОСТ 4233 «Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».
23. ГОСТ 33884 «Свекла сахарная. Технические условия».
24. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79.
| ББК 51.238 |
|---|