МУК 4.1.3781-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фенпропиморфа в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 22.08.2022)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 22 августа 2022 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЕНПРОПИМОРФА В БОТВЕ И КОРНЕПЛОДАХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3781-22
Разработаны: ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» (О.К. Остроухова, А.С. Комарова, В.И. Долженко); ООО «Инновационный центр защиты растений» (Д.А. Плахов).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 августа 2022 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии (далее — ГЖХ) для определения массовой концентрации фенпропиморфа в ботве и корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,1 мг/кг включительно.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические и токсикологические свойства
2.1. Фенпропиморф. (+/-)-цис-4-[3-(4-трет-Бутилфенил)-2-метилпропил]-2,6-диметилморфолин (ИЮПАК). Брутто-формула: C20H33NO. Молекулярная масса 303,5. Бесцветная жидкость без запаха. Давление пара (плюс 20 °C) 3,5 мПа. Растворимость (плюс 20 °C): в воде 4,3 мг/л; ацетоне, хлороформе, этилацетате, циклогексане, толуоле, диэтиловом эфире, этаноле > 1 кг/кг. Стабилен при комнатной температуре в закрытой таре как минимум 3 года. Не гидролизуется при pH 5; 7 и 9 (при плюс 25 °C). Коэффициент распределения н-октанол/вода: Kow log P = 2,6 (pH 5), 4,1 (pH 7), 4,4 (pH 9).
<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).
2.2. Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (ЛД50) для мышей и крыс — более 2230 мг/кг; острая дермальная токсичность (ЛД50) для крыс — более 4000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (ЛК50) для крыс — более 2,9 мг/дм3.
Область применения. Системный фунгицид с защитным и лечебным действием.
III. Погрешность измерений
3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1, для соответствующих диапазонов концентраций.
Объект анализа, диапазон определяемых концентраций, полнота извлечения фенпропиморфа, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0,95
IV. Метод измерений
4.1. Определение фенпропиморфа основано на экстракционном извлечении определяемого компонента из образцов свеклы сахарной водно-ацетоновым раствором, очистке раствора, перераспределением аналита в органическую фазу и последующем анализе экстракта методом капиллярной ГЖХ с использованием термоионного детектора. Идентификация фенпропиморфа проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
V. Средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Газовый хроматограф с термоионным детектором. Предел детектирования 1·10-12 г(Р)/с, относительное среднее квадратическое отклонение выходного сигнала (СКО), %, не более — по площади и высоте пика — 4, времени удерживания — 0,3 | - |
| Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допускаемой погрешности 0,1 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Весы технические с пределом взвешивания до 150 г и пределом допускаемой погрешности 0,1 г | ГОСТ Р 53228 |
| Пипетки градуированные объемом 1, 2, 5 и 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Колбы мерные на 25 и 100 см3 | ГОСТ 1770 |
| Микрошприц МШ-10 на 10 мм3, с ценой деления 0,2 мм3, предел допускаемого СКО случайной составляющей погрешности 1% | - |
| Цилиндры мерные на 50 и 100 см3 | ГОСТ 1770 |
Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Азот особой чистоты, в баллонах с редуктором | ГОСТ 9293 |
| Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная) | ГОСТ Р 52501 |
| Ацетон, особой чистоты | - |
| Фенпропиморф, аналитический стандарт с содержанием основного компонента 99,6% | - |
| н-Гексан, химически чистый | - |
| Дихлорметан, химически чистый | - |
| Натрий хлористый, чистый для анализа | ГОСТ 4233 |
| Натрий сернокислый б/в (сульфат), чистый для анализа | ГОСТ 4166 |
Примечание: допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
Вспомогательные устройства, материалы
Примечание: допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф и тандемный масс-селективный детектор.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать нормы и правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.
<2> Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 № 536 «Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности „Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением“ (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный № 61998).»
6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом капиллярной газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VII. Условия измерений
7.1 При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <3>.
<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные Минздравом СССР 21.08.1979 № 2051-79, ГОСТ Р 53036 «Национальный стандарт Российской Федерации. Свекла сахарная. Методы испытаний», ГОСТ 1722 «Государственный стандарт Союза ССР. Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая. Технические условия».
Пробы корнеплодов сахарной свеклы хранят в герметичной таре в морозильной камере с температурой минус 18 °C до анализа не более 1 года. Ботву сахарной свеклы хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре минус 18 °C до анализа не более 1 года.
VIII. Подготовка к выполнению измерений
8.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление основного и градуировочных растворов.
Очистка органических растворителей.
Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с типовыми методиками.
8.2 Кондиционирование колонки.
Капиллярную колонку перед анализом кондиционируют в токе азота при температуре плюс 250 °C до стабилизации нулевой линии.
8.3 Приготовление растворов.
8.3.1. Раствор для экстракции ацетон-вода в соотношении 8:2. В плоскодонную колбу на 250 см3 вносят 80 см3 ацетона и 20 см3 дистиллированной воды, раствор перемешивают. Готовый раствор можно хранить при комнатной температуре в течение 1 месяца.
8.3.2. Приготовление насыщенного раствора хлористого натрия. 380 г NaCl растворяют при нагревании в 1000 см3 деионизованной воды, фильтруют через бумажный фильтр и охлаждают до комнатной температуры. Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 месяцев.
8.4 Приготовление основного и градуировочных растворов.
8.4.1. Основной раствор фенпропиморфа № 1 с концентрацией 1,0 мг/см3: точную навеску фенпропиморфа (50,0 +/- 0,50) мг помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, растворяют в ацетоне и доводят объем до метки тем же растворителем.
Раствор фенпропиморфа № 2 с концентрацией 10 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 пипеткой вносят 1 см3 основного раствора фенпропиморфа № 1 и доводят объем до метки гексаном.
8.4.2 Приготовление градуировочных растворов.
Градуировочные растворы с концентрациями фенпропиморфа 0,2, 0,4, 1,0 и 2,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя гексан.
8.4.2.1. Раствор № 3 с концентрацией 2,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 пипеткой вносят 2,0 см3 раствора № 2 и доводят объем до метки гексаном.
8.4.2.2. Раствор № 4 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 пипеткой вносят 1,0 см3 раствора № 2 и доводят объем до метки гексаном.
8.4.2.3. Раствор № 5 с концентрацией 0,4 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 пипеткой вносят 0,4 см3 раствора № 2 и доводят объем метки гексаном.
8.4.2.4. Раствор № 6 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 пипеткой вносят 0,2 см3 раствора № 2 и доводят объем до метки гексаном.
Основной раствор фенпропиморфа можно хранить в холодильнике при температуре плюс 0 — 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение 1 недели.
При изучении полноты извлечения фенпропиморфа из растительных образцов используют ацетоновые растворы, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетоном.
8.5 Установление градуировочной характеристики.
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации фенпропиморфа в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по не менее, чем 4 растворам для градуировки.
В инжектор хроматографа микрошприцем вводят по 1 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
IX. Выполнение определения
9.1 Определение фенпропиморфа в ботве и корнеплодах сахарной свеклы.
Навеску измельченной ботвы или корнеплодов (20,0 +/- 0,1) г помещают в плоскодонную коническую колбу объемом 250 см3, добавляют 70 см3 смеси ацетон-вода в соотношении 8:2 по объему и экстрагируют фенпропиморф в ультразвуковой ванне в течение 10 минут. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр и повторяют экстракцию еще раз 70 см3 смеси ацетон-вода в соотношении 8:2 по объему. К полученному объединенному экстракту добавляют 30 см3 дистиллированной воды и упаривают до водного остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше плюс 40 °C. Водный остаток фильтруют через предварительно смоченный дистиллированной водой бумажный фильтр. Фильтр промывают 1 — 2 см3 воды. Полученный водный раствор переносят в делительную воронку объемом 500 см3, добавляют 10 см3 насыщенного раствора хлорида натрия и экстрагируют фенпропиморф 30 см3 дихлорметана. После разделения слоев нижний дихлорметановый слой сливают в круглодонную колбу объемом 100 см3, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию дважды повторяют порциями дихлорметана по 30 см3. Объединенный дихлорметановый раствор упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани плюс 40 °C до полного удаления растворителя. Сухой остаток растворяют в 1 см3 гексана, выдерживают 10 минут, переносят в виалу и хроматографируют.
9.2 Условия хроматографирования.
Газовый хроматограф с термоионными детектором и кварцевой капиллярной колонкой длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой, состоящей из 5% фенил- и 95% диметилполисилоксана, толщина слоя 0,25 мкм. Температура термостата колонки программируется от плюс 120 °C (3 мин) до плюс 300 °C (5 мин) со скоростью 25 °C/мин, температура испарителя плюс 290 °C, температура детектора плюс 310 °C. Расход водорода — 3 см3/мин, воздуха — 60 см3/мин, газ-носитель — азот, поток газа-носителя через колонку 2 см3/мин (в режиме постоянного потока) без сброса, поддув детектора 10 см3/мин. Объем вводимой пробы 1 мм3. Ориентировочное время удерживания фенпропиморфа 8,4 мин.
X. Обработка результатов анализа
10.1. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание фенпропиморфа в пробе X (мг/кг) вычисляют по формуле:
где C — концентрация вещества, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см3;
f — полнота извлечения фенпропиморфа, приведенная в табл. 2, %;
V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3 (1 см3);
m — окончательная масса анализируемого образца, г (20 г).
Содержание остаточных количеств фенпропиморфа в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор фенпропиморфа с концентрацией 2,0 мкг/см3, разбавляют гексаном.
XI. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
11.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r,
где X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (приведен в табл. 3.1).
При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XII. Оформление результатов
12.1 Результат анализа представляют в виде:
(X_{\text{ср}} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95,
где Xср — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \delta \times X_{\text{ср}}/100,
где \delta — граница относительной погрешности методики (приведена в табл. 3.1), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,01 мг/кг, где 0,01 мг/кг — предел определения фенпропиморфа в корнеплодах сахарной свеклы).»
XIII. Контроль качества результатов измерений
13.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6.
Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Градуировочную характеристику следует проверять перед каждой серией измерений, при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
\frac{|C - C_{\text{к}}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.},
где C — аттестованное значение массовой концентрации фенпропиморфа в градуировочном растворе;
Cк — результат контрольного измерения массовой концентрации фенпропиморфа в градуировочном растворе;
\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).
Если расхождение превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов фенпропиморфа. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново.
Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:
C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime},
где \pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,
где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\Delta = \delta \times X_{\text{ср}}/100,
где \delta — граница относительной погрешности методики (приведена в табл. 3.1), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
\text{К}_{\text{к}} = X_{\text{с}}\prime_{\text{р}} - X_{\text{ср}} - C_{\text{д}},
где X_{\text{с}}\prime_{\text{р}} , Xср, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11.1) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} .
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении этого условия процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R,
где X1, X2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (приведен в табл. 3.1), %.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 № 536 «Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности „Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением“.»
3. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов от 21.08.1979 № 2051-79.
4. ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6 «Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Части 1 — 6».
5. ГОСТ 12.1.007 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
6. ГОСТ 12.1.019 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
7. ГОСТ 12.1.004 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
8. ГОСТ 12.4.009 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
9. ГОСТ 12.0.004 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
10. ГОСТ Р 53228 «Национальный стандарт Российской Федерации. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
11. ГОСТ Р 52501 «Национальный стандарт Российской Федерации. Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
12. ГОСТ 9293 (ИСО 2435) «Межгосударственный стандарт. Азот газообразный и жидкий. Технические условия».
13. ГОСТ 25336 «Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
14. ГОСТ 4233 «Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».
15. ГОСТ Р 53036 «Национальный стандарт Российской Федерации. Свекла сахарная. Методы испытаний».
16. ГОСТ 1722 «Государственный стандарт Союза ССР. Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая. Технические условия».
17. ГОСТ 4166 «Государственный стандарт Союза ССР. Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия».
18. ГОСТ 1770 «Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».