МУК 4.1.3779-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств диметоморфа в плодах и соке яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 22.08.2022)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 22 августа 2022 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИМЕТОМОРФА В ПЛОДАХ И СОКЕ ЯБЛОК МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3779-22
1. Разработаны: ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» (А.С. Комарова, Т.Д. Черменская); ООО «Инновационный центр защиты растений» (А.Б. Лаптиев).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 августа 2022 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) для определения массовой концентрации диметоморфа в плодах и соке яблок в диапазоне концентраций от 0,05 до 0,5 мг/кг включительно.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические и токсикологические свойства
2.1. Диметоморф: (E, Z)-4-[3-(4-хлорфенил)-3-(3,4-диметоксифенил)акрилоил]морфолин (ИЮПАК) <1>. Брутто-формула: C21H22ClNO4. Молекулярная масса 387,9. Смесь (E)- и (Z)-изомеров в соотношении 1:1 представляет собой бесцветные кристаллы. Температура плавления: (E) — (136,8 — 138,3) °C, (Z) — (166,3 — 168,5) °C. Давление пара при плюс 25 °C: (E) — 9,7 x 10-4 мПа, (Z) — 1,0 x 10-3 мПа. Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода Kow logP: (E) — 2,63, (Z) — 2,73 (20 °C). Растворимость в воде (мг/дм3, плюс 20 °C): 81,1 (pH 4), 49,2 (pH 7), 41,8 (pH 9). Гидролитически и термически стабилен при нормальных условиях. Растворимость в органических растворителях (г/дм3, 20 °C): ацетон — 100,4, толуол — 49,5, дихлорметане — 461, гексан — 0,11, метанол — 39, этилацетате — 48,3.
<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).
2.2. Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная активность для крыс: ЛД50 3900 мг/кг. Острая кожная для крыс: ЛД50 > 2000 мг/кг. Ингаляционная для крыс: СК50 > 4,42 мг/л. Механизм действия: локальный системный фунгицид с хорошей защитной и антиспоровой активностью. Ингибирует биосинтез фосфолипидов и синтез клеточных стенок.
2.3. Область применения. Фунгицид, эффективный против болезней, вызванных патогенами из класса оомицетов, таких как переноспороз, фитофтороз, на винограде, картофеле, томатах. Используется в комбинации с контактными фунгицидами.
III. Погрешность измерений
3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 3.1, для соответствующих диапазонов концентраций.
Полнота извлечения диметоморфа, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0,95
IV. Метод измерений
4.1. Определение диметоморфа основано на экстракционном извлечении определяемого компонента из проб органическим растворителем, очистке экстракта на сорбенте и последующем анализе экстракта методом ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового (далее — УФ) детектора. Идентификация диметоморфа проводится по времени удерживания, количественное определение — по сумме (E)- и (Z)-изомеров методом абсолютной калибровки. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
V. Средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в таблицах 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Жидкостный хроматограф (макс. рабочее давление 34,5 МПа) с УФ-детектором (диапазон длин волн (190 — 700) нм), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки, относительное среднее квадратическое отклонение (СКО) выходного сигнала по площади пика 1%, по времени удерживания 0,3% | - |
| Весы лабораторные общего назначения, наибольший предел взвешивания 150 г, предел допустимой погрешности 5 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 81/210 г, предел допустимой погрешности 0,1/0,3 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Дозаторы пипеточные переменного объема от 10 до 100 мм3, от 100 до 1000 мм3, от 1000 до 5000 мм3 | ГОСТ 28311 |
| Колбы мерные на 25 и 100 см3 | ГОСТ 1770 |
| Цилиндры мерные на 50 и 100 см3 | ГОСТ 1770 |
Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Ацетонитрил для ВЭЖХ | - |
| Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная) | ГОСТ Р 52501 |
| Диметоморф с содержанием основного вещества 99,5% | - |
| Кислота ортофосфорная 98%, химически чистая | ГОСТ 6552 |
| Магний сернокислый безводный, 97% | - |
| Натрий лимоннокислый трехзамещенный, 2-водный, химически чистый | - |
| Натрий хлористый, чистый для анализа | ГОСТ 4233 |
| Натрий лимоннокислый двузамещенный, 1,5-водный, химически чистый | - |
| Сорбент для твердофазной экстракции на основе силикагеля с привитыми первичными и вторичными аминными группами (Primary Secondary Amine (PSA)), площадь поверхности ~ 500 м2/г, средний размер пор 70 А, средний размер частиц 50 мкм | - |
Примечание: допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
Вспомогательные устройства, материалы
Примечание: допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф и тандемный масс-селективный детектор.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004, ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать нормы и правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.
<2> Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 № 536 «Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности „Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением“ (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный № 61998).»
6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментальное соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VII. Условия измерений
7.1 При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
VIII. Подготовка к выполнению измерений
8.1 Очистка органических растворителей.
Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.
8.2 Кондиционирование колонки.
Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,5 — 1,0) см3/мин до стабилизации нулевой линии.
8.3 Приготовление растворов.
8.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,50 +/- 0,01) г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в деионизованной воде и доводят объем до метки.
8.3.2. Для приготовления подвижной фазы для ВЭЖХ в мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 600 см3 ацетонитрила и доводят до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.
Растворы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.
8.4 Приготовление основного и градуировочных растворов.
8.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску диметоморфа (50,0 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.
8.4.2 Приготовление градуировочных растворов.
Градуировочные растворы с концентрациями диметоморфа 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.
8.4.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 дозатором вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.
8.4.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 5,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
8.4.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
8.4.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 дозатором вносят 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
8.4.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 дозатором вносят 0,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре плюс (0 — 4) °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение недели.
При изучении полноты определения диметоморфа используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.
8.5 Установление градуировочной характеристики.
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость суммы площадей пиков (E)- и (Z)-изомеров от концентрации диметоморфа в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по не менее, чем 4-м растворам для градуировки.
В инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.
Градуировки признают удовлетворительными, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочные зависимости признают стабильными при выполнении следующего условия:
\frac{|C - C_{\text{к}}|}{\text{С}} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.},
где C — известная концентрация диметоморфа в градуировочном растворе, мкг/см3;
Cк — результат контрольного измерения массовой концентрации диметоморфа в градуировочном растворе, мкг/см3;
\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).
Если расхождение превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов диметоморфа. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново.
Градуировочную характеристику следует проверять перед началом измерений, при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы.
8.6 Отбор проб и хранение.
Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <3>.
<3> Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные Минздравом СССР 21.08.1979 № 2051-79; ГОСТ 27572 «Межгосударственный стандарт. Яблоки свежие для промышленной переработки. Технические условия»; ГОСТ 26313 «Межгосударственный стандарт. Продукты переработки фруктов и овощей. Правила приемки и методы отбора проб».
Пробы плодов яблок хранят до анализа в герметичной таре в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C, сок хранят в холодильнике при температуре плюс (0 — 4) °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.
IX. Выполнение определения
9.1 Экстракция диметоморфа из плодов и сока яблок.
Навеску измельченных плодов или сока (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, последовательно добавляют 10 см3 ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 1 г натрия лимоннокислого трехзамещенного 2-водного и 0,5 г натрия лимоннокислого двузамещенного 1,5-водного. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 5 см3, переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, содержащую 150 мг сорбента на основе силикагеля с привитыми первичными и вторичными аминными группами (PSA) и 900 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин. От верхнего слоя отбирают 2,0 см3 и упаривают досуха в токе воздуха при температуре не более плюс 40 °C, остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 20 мм3 вводят в хроматограф.
9.2 Условия хроматографирования.
Жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18 (250 x 4,6) мм, 5 мкм. Температура колонки плюс (25 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 60:40. Скорость потока элюента 0,8 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 245 нм. Объем вводимой пробы 20 мм3. Время удерживания: (E)-диметоморфа (7,0 +/- 0,1) мин, (Z)-диметоморфа (7,5 +/- 0,1) мин.
X. Обработка результатов анализа
10.1. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки по сумме (E)- и (Z)-изомеров. Содержание диметоморфа в пробе X (мг/кг) вычисляют по формуле:
где C — концентрация диметоморфа, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков (E)- и (Z)-изомеров, мкг/см3;
f — полнота извлечения диметоморфа, приведенная в таблице 3.2, %;
V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3 (1 см3);
m — окончательная масса анализируемого образца (аликвота, соответствующая навеске плодов или сока 2 г).
Содержание остаточных количеств диметоморфа в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор диметоморфа с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
XI. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
11.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r,
где X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (приведен в таблице 3.1).
При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XII. Оформление результатов
12.1 Результат анализа представляют в виде:
(X_{cp} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95,
где Xср — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \delta \times X_{cp}/100,
где \delta — граница относительной погрешности методики (приведена в таблице 3.1), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения»
(например: менее 0,05 мг/кг*, где * — 0,05 мг/кг — предел обнаружения диметоморфа в соке яблок).
XIII. Контроль качества результатов измерений
13.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6.
13.2 Стабильность градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят ежедневно перед анализом серии проб. Средствами контроля являются свежеприготовленные образцы для градуировки с массовыми концентрациями, соответствующими нижней и верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики.
Градуировочная характеристика признается стабильной при выполнении условия, указанного в п. 8.5.
13.3. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:
\text{С}_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},\text{Х}} + \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime},
где \pm \Delta_{\text{л},\text{Х}} ( \pm \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,
где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\Delta = \delta \times X_{cp}/100,
где \delta — граница относительной погрешности методики (приведена в таблице 3.1), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
\text{К}_{\text{к}} = \text{Х}_{\text{с}}\prime_{\text{р}} - \text{Х}_{\text{ср}} - \text{С}_{\text{д}},
где \text{Х}_{\text{с}}\prime_{\text{р}} , Xср, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11.1) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}} .
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении этого условия процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.4. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R,
где X1, X2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (приведен в таблице 3.1), %.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 № 536 «Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности „Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением“.»
3. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов от 21.08.1979 № 2051-79.
4. ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6 «Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Части 1 — 6».
5. ГОСТ 12.1.007 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
6. ГОСТ 12.1.019 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
7. ГОСТ 12.1.004 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
8. ГОСТ 12.4.009 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
9. ГОСТ 12.0.004 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
10. ГОСТ Р 53228 «Национальный стандарт Российской Федерации. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
11. ГОСТ Р 52501 «Национальный стандарт Российской Федерации. Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
12. ГОСТ 25336 «Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
13. ГОСТ 4233 «Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».
14. ГОСТ 28311 «Межгосударственный стандарт. Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний».
15. ГОСТ 27572 «Межгосударственный стандарт. Яблоки свежие для промышленной переработки. Технические условия».
16. ГОСТ 26313 «Межгосударственный стандарт. Продукты переработки фруктов и овощей. Правила приемки и методы отбора проб».
17. ГОСТ 6552 «Межгосударственный стандарт. Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия».
18. ГОСТ 1770 «Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».