МУК 4.1.3778-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств гекситиазокса в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 22.08.2022)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 22 августа 2022 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ГЕКСИТИАЗОКСА В БОТВЕ И КОРНЕПЛОДАХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3778-22
1. Разработаны ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» (Т.Д. Черменская, В.И. Долженко); ООО «Инновационный центр защиты растений» (А.С. Комарова).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 августа 2022 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) для определения массовой концентрации гекситиазокса в ботве и корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне концентраций от 0,05 до 0,5 мг/кг включительно.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические и токсикологические свойства
2.1. Гекситиазокс. (4RS,5RS)-5-(4-хлорфенил)-N-циклогексил-4-метил-2-оксо-1,3-тиазолидин-3-карбоксамид (ИЮПАК) <1>. Брутто-формула: C17H21ClN2O2S.
<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).
Молекулярная масса 352,9. Химически чистое вещество представляет собой бесцветные кристаллы. Температура плавления плюс (108,0 — 108,5) °C. Давление пара при плюс 20 °C 0,0034 мПа. Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода Kow logP = 2,63. Растворимость: в воде — 0,5 мг/дм3 (при плюс 20 °C), в хлороформе — 1379, метаноле — 206, ацетоне — 160, ацетонитриле — 28,6, гексане — 4 (г/дм3, при плюс 20 °C). Стабилен к воздействию света, воздуха. Стабилен при нагревании до плюс 300 °C. Стабилен в водных растворах при pH 5, 7 и 9. Для водных растворов на свету DT50 = 16,7 дней.
2.2. Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная и дермальная токсичность ЛД50 для крыс > 5000 мг/кг. Ингаляционная ЛК50 (4 часа) для крыс более 2 мг/м3 воздуха.
2.3. Область применения. Несистемный акарицид с контактной активностью. Не активен против имаго, но имеет овицидную, ларвицидную и нимфацидную активность в отношении многих видов фитофаговых клещей на плодовых, цитрусовых, овощных культурах, винограде и хлопке.
III. Погрешность измерений
3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1, для соответствующих диапазонов концентраций.
Полнота извлечения гекситиазокса, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0,95
IV. Метод измерения
4.1. Определение гекситиазокса основано на экстракционном извлечении определяемого компонента из проб органическим растворителем, очистке экстракта на сорбентах и последующем анализе экстракта методом ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового (далее — УФ) детектора. Идентификация гекситиазокса проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
V. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средства измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Жидкостный хроматограф (макс. рабочее давление 34,5 МПа) с УФ-детектором (диапазон длин волн 190 — 700 нм), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки; относительное среднее квадратическое отклонение (СКО) выходного сигнала по площади пика 1%, по времени удерживания 0,3% | - |
| Весы лабораторные общего назначения, наибольший предел взвешивания 150 г, предел допустимой погрешности 5 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 81/210 г, предел допустимой погрешности 0,1/0,3 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Дозаторы пипеточные переменного объема от 10 до 100 мм3, от 100 до 1000 мм3 и от 1000 до 5000 мм3 | ГОСТ 28311 |
| Колбы мерные на 10, 100 и 1000 см3 | ГОСТ 1770 |
| Цилиндры мерные на 50 и 100 см3 | ГОСТ 1770 |
Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Ацетонитрил для ВЭЖХ | - |
| Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная) | ГОСТ Р 52501 |
| Гекситиазокс с содержанием основного вещества 99,9% | - |
| Кислота ортофосфорная 98%-я химически чистая | ГОСТ 6552 |
| Магний сернокислый безводный 97%-й | - |
| Натрий хлористый чистый для анализа | ГОСТ 4233 |
| Сорбент для твердофазной экстракции на основе силикагеля с привитыми первичными и вторичными аминными группами (Primary Secondary Amine (PSA)), площадь поверхности — 500 м2/г, средний размер пор 70 А, средний размер частиц 50 мкм | - |
| Уголь активированный ОУ-А (осветляющий уголь активный) (удельная поглощающая поверхность более 1200 м2 в 1 г угля) | ГОСТ 4453 |
Примечание: допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
Вспомогательные устройства и материалы
Примечание: допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать нормы и правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.
<2> Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением, утвержденные приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 № 116.
6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VII. Отбор и хранение проб
7.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <3>.
<3> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные Минздравом СССР 21.08.1979 № 2051-79; ГОСТ 33884 «Международный стандарт. Свекла сахарная. Технические условия»; ГОСТ Р 53036 «Национальный стандарт Российской Федерации. Свекла сахарная. Методы испытаний».
Пробы ботвы и корнеплодов сахарной свеклы до анализа хранят раздельно в герметичной полиэтиленовой таре в морозильной камере с температурой минус 18 °C не более 1 года.
VIII. Условия измерений
8.1 При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
IX. Подготовка к выполнению измерений
9.1 Очистка органических растворителей.
Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют. Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.
9.2 Кондиционирование колонки.
Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы 0,5 — 1,0 см3/мин до стабилизации нулевой линии.
9.3 Приготовление растворов.
9.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,50 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1000 см3, растворяют в деионизованной воде и доводят объем до метки.
9.3.2. Для приготовления подвижной фазы для ВЭЖХ в мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 850 см3 ацетонитрила и доводят до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.
Растворы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.
9.4 Приготовление основного, рабочего и градуировочных растворов.
9.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску гекситиазокса (50,0 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.
9.4.2. Рабочий раствор с концентрацией 10,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 2,0 см3 основного раствора и доводят до метки ацетонитрилом.
9.4.3 Приготовление градуировочных растворов.
Градуировочные растворы с концентрациями гекситиазокса 0,025; 0,05; 0,1; 0,2 и 0,5 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя ацетонитрил.
9.4.3.1. Раствор № 1 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 дозатором вносят 0,5 см3 рабочего раствора и доводят до метки ацетонитрилом.
9.4.3.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 дозатором вносят 0,2 см3 рабочего раствора и доводят объем до метки ацетонитрилом.
9.4.3.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 дозатором вносят 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки ацетонитрилом.
9.4.3.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 дозатором вносят 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки ацетонитрилом.
9.4.3.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,025 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 дозатором вносят 0,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки ацетонитрилом.
Основной и рабочий растворы можно хранить в холодильнике при температуре плюс (0 — 4) °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение недели.
При изучении полноты определения гекситиазокса используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из рабочего раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.
9.5 Установление градуировочной характеристики.
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация гекситиазокса в растворе) в инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2. Определяют площади пиков вещества, на основании которых устанавливается градуировочная зависимость.
Градуировки признают удовлетворительными, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочные зависимости признают стабильными при выполнении следующего условия:
\frac{|C - C_{\text{к}}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.},
где C — известная концентрация гекситиазокса в градуировочном растворе, мкг/см3;
Cк — результат контрольного измерения массовой концентрации гекситиазокса в градуировочном растворе, мкг/см3;
\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).
Если расхождение превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов гекситиазокса. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики ее устанавливают заново.
Градуировочную характеристику следует проверять перед началом измерений, при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы.
X. Выполнение определения
10.1. Экстракция гекситиазокса из ботвы или корнеплодов сахарной свеклы.
Навеску измельченных ботвы или корнеплодов (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, последовательно добавляют 10 см3 ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния и 1 г хлористого натрия. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 5 см3, переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, содержащую 15 мг активированного угля, 150 мг сорбента на основе силикагеля с привитыми первичными и вторичными аминными группами (PSA) и 900 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин. От верхнего слоя отбирают 1,0 см3, переносят в виалу и анализируют по п. 10.2.
10.2 Условия хроматографирования.
Жидкостной хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18 (250 x 4,6) мм, 5 мкм. Температура колонки плюс (25 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 85:15. Скорость потока элюента 1,0 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 225 нм. Объем вводимой пробы 20 мм3. Приблизительное время удерживания 8,5 мин.
XI. Обработка результатов анализа
11.1. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание гекситиазокса в пробе X (мг/кг) вычисляют по формуле:
X = \frac{C \cdot V \cdot 100}{m \cdot f} ,
где C — концентрация гекситиазокса, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см3;
f — полнота извлечения гекситиазокса, приведенная в табл. 3.2, %;
V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3 (1 см3);
m — окончательная масса анализируемого образца, г (аликвота, равная 1 г).
Содержание гекситиазокса в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор гекситиазокса с концентрацией 0,5 мкг/см3, разбавляют ацетонитрилом.
XII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r,
где X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (приведен в табл. 3.1).
При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XIII. Оформление результатов
13.1 Результат анализа представляют в виде:
(X_{\text{ср}} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95,
где Xср — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta \cdot X_{\text{ср}}}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (приведена в табл. 3.1), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «Содержание вещества в пробе менее нижней границы определения». Например: менее 0,05 мг/кг*, где * — 0,05 мг/кг — предел обнаружения гекситиазокса в ботве свеклы.
XIV. Контроль качества результатов измерений
14.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6.
Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят ежедневно перед анализом серии проб. Средствами контроля являются свежеприготовленные образцы для градуировки с массовыми концентрациями, соответствующими нижней и верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики.
Градуировочная характеристика признается стабильной при выполнении условия, указанного в п. 9.5.
14.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:
C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime},
где \pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,
где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\Delta = \frac{\delta \cdot X_{\text{ср}}}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (приведена в табл. 3.1), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
\text{К}_{\text{к}} = X_{\text{с}}\prime_{\text{р}} - X_{\text{ср}} - C_{\text{д}},
где X_{\text{с}}\prime_{\text{р}} , Xср, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 12.1) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} .
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении этого условия процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
14.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R,
где X1, X2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (приведен в табл. 3.1), %.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Приказ Ростехнадзора от 15.12.2020 № 536 «Об утверждении федеральных норм и правил в области промышленной безопасности „Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением“.»
3. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов от 21.08.1979 № 2051-79.
4. ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6 «Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
5. ГОСТ 12.1.007 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
6. ГОСТ 12.1.019 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
7. ГОСТ 12.1.004 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
8. ГОСТ 12.4.009 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
9. ГОСТ 12.0.004 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
10. ГОСТ Р 53228 «Национальный стандарт Российской Федерации. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
11. ГОСТ 1770 «Межгосударственный стандарт. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
12. ГОСТ 28311 «Межгосударственный стандарт. Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний».
13. ГОСТ Р 52501 «Национальный стандарт Российской Федерации. Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
14. ГОСТ 6552 «Межгосударственный стандарт. Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия».
15. ГОСТ 4233 «Межгосударственный стандарт. Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия».
16. ГОСТ 4453 «Государственный стандарт Союза ССР. Уголь активный осветляющий древесный порошкообразный. Технические условия».
17. ГОСТ 25336 «Межгосударственный стандарт. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
18. ГОСТ 33884 «Международный стандарт. Свекла сахарная. Технические условия».
19. ГОСТ Р 53036 «Национальный стандарт Российской Федерации. Свекла сахарная. Методы испытаний».