МУК 4.1.3776-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика определения синефрина и октопамина в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 07.06.2022)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 7 июня 2022 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИНЕФРИНА И ОКТОПАМИНА В БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВКАХ К ПИЩЕ И СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОЙ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3776-22
1. Разработаны ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (В.А. Тутельян, К.И. Эллер, И.Б. Перова, А.В. Мусатов,).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 7 июня 2022 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) с УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице (далее — ВЭЖХ-ДМД) и масс-спектрометрическим детектором (далее — ВЭЖХ-МС) для определения массовых концентраций синефрина и октопамина в биологически активных добавках (далее — БАД) к пище и специализированной пищевой продукции (далее — СПП) в диапазоне от 0,05 до 30,0 мг/г.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические свойства синефрина и октопамина
2.1. Рациональные названия: синефрин — (+/-)-(4-[1-гидрокси-2-(метиламино)этил]фенол, октопамин — (+/-)-4-(2-амино-1-гидрокси-этил)фенол (в виде гидрохлорида). Химические названия и химические формулы веществ изображены на рис. 1.
Рис. 1. Структурные формулы синефрина и октопамина
Синефрин и октопамин представляют собой порошки или кристаллы от белого до светло-желтого и от светло-бежевого до бежевого цвета. Свободные октопамин и синефрин малорастворимы в воде, соответствующие гидрохлориды растворимы в воде на уровне 40 — 50 мг/мл. Молярная масса синефрина составляет 167,21 г/моль, октопамина — 153,18 г/моль.
УФ-спектры синефрина и октопамина в метаноле характеризуются максимумами поглощения при длинах волн 226 нм и 276 нм.
Синефрин и октопамин применяются в БАД к пище и СПП для контроля массы тела и улучшения спортивных результатов.
III. Метод измерений
3.1. Методика основана на определении синефрина и октопамина методом ион-парной ОФ ВЭЖХ-ДМД с подтверждением структуры с помощью ВЭЖХ-МС. Подготовка пробы включает в себя экстракцию водно-метанольным раствором. Идентификацию синефрина и октопамина проводят по совпадению времен удерживания, УФ-спектров и данных МС. Количественное определение проводится по данным ВЭЖХ-ДМД методом внешней калибровки.
IV. Метрологические характеристики
4.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические характеристики
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 2 - 4.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Хроматограф жидкостный с ДМД | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Хроматограф жидкостный с МС-детектором | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Весы лабораторные аналитические | Наибольший предел взвешивания 110 г, дискретность 0,0001 г, класс точности специальный (I) по ГОСТ Р 53228 |
| Колбы | Тип 2-50-2, 2-500-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Стаканы | Тип В-1-500 по ГОСТ 25336 |
| Цилиндры | Тип 1-100-1, 1-500-1 по ГОСТ 1770 |
| Пипетки | Тип 1-2-2-1, 1-2-2-2 и 1-2-2-5 по ГОСТ 29227 |
| Дозаторы медицинские лабораторные | ДПОП-1-100-1000, ДПОП-1-500-5000 по ГОСТ 28311 |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Вспомогательное оборудование и материалы
Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Синефрин, стандарт | Содержание основного вещества не менее 95% |
| Октопамина гидрохлорид, стандарт | Содержание основного вещества не менее 95% |
| Метанол для ВЭЖХ | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| Ацетонитрил для ВЭЖХ | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| Вода дистиллированная | ГОСТ Р 58144 |
| Вода для лабораторного анализа | ГОСТ Р 52501 |
| Формиат аммония | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Гексансульфоновой кислоты натриевая соль | Содержание основного вещества не менее 95% |
Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
VI. Требования безопасности проведения измерений и квалификации операторов
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.
6.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов.
6.3. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалистов, имеющих высшее или среднее специальное образование, имеющих опыт работы в химическо-аналитической лаборатории, владеющих методом ВЭЖХ.
VII. Отбор проб
7.1. Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией по отбору проб с целью определения токсичных элементов для каждого конкретного вида продукции.
VIII. Условия измерений
8.1 При проведении измерений соблюдаются следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха 15 — 30 °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
IX. Подготовка к выполнению измерений
9.1.1. Приготовление растворов хранения стандартов синефрина и октопамина.
9.1.2 Приготовление раствора хранения стандарта синефрина.
Навеску синефрина (25 +/- 0,2) мг помещают в мерную колбу на 50 см3, добавляют 40 см3 метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентраций 0,5 мг/см3.
Приготовленный раствор хранят при температуре плюс (4 — 8) °C не более 12 месяцев.
9.1.3 Приготовление раствора хранения стандарта октопамина.
Навеску октопамина гидрохлорида (31 +/- 0,2) мг помещают в мерную колбу на 50 см3, добавляют 40 см3 метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентрацией 0,5 мг/см3.
Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 — 8 °C не более 12 месяцев.
9.2. Приготовление градуировочных рабочих растворов стандартов синефрина и октопамина.
9.2.1. Приготовление градуировочных рабочих растворов стандарта синефрина.
Для получения разбавленных градуировочных растворов синефрина с концентрацией 0,001; 0,01; 0,1 мг в см3 в ряд колб на 50 см3 помещают 0,1 см3, 1 см3 и 10 см3 раствора хранения стандарта синефрина и доводят объем раствора до 50 см3 метанолом.
Приготовленные растворы хранят при температуре 4 — 8 °C не более 3 месяцев.
Далее строят график зависимости площадей пиков (S) градуировочных растворов от концентрации синефрина (мг/см3) A = f(C) по четырем точкам 0,001; 0,01; 0,1; 0,5 мг/см3. По уравнению зависимости графика с учетом разбавления вычисляют содержание синефрина в пробе.
9.2.2. Приготовление градуировочных рабочих растворов стандарта октопамина.
Для получения разбавленных градуировочных растворов октопамина с концентрацией 0,001; 0,01; 0,1 мг в см3 в ряд колб на 50 см3 помещают 0,1 см3, 1 см3 и 10 см3 раствора хранения стандарта октопамина и доводят объем раствора до 50 см3 метанолом.
Приготовленные растворы хранят при температуре плюс 4 — 8 °C не более 3 месяцев.
Далее строят график зависимости площадей пиков (S) градуировочных растворов от концентрации октопамина (мг/см3) A = f(C) по четырем точкам 0,001; 0,01; 0,1; 0,5 мг/см3. По уравнению зависимости графика с учетом разбавления вычисляют содержание октопамина в пробе.
9.2.3 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов. При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух градуировочных растворов, содержание синефрина и октопамина в которых входит в диапазон линейности градуировочной характеристики от 0,001 до 0,5 мг/см3. Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
A = \frac{(X - C) \cdot 100}{C} \leq B , где
X — концентрация синефрина или октопамина в пробе при контрольном измерении, мг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора синефрина или октопамина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мг/см3;
B — норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).
Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново.
9.3 Приготовление подвижной фазы.
9.3.1. Приготовление водного раствора формиата аммония (10 ммоль NH4HCO2).
Для приготовления раствора формиата аммония NH4HCO2 с концентрацией 10 ммоль в стакан объемом 500 см3 отмеряют 400 см3 воды для лабораторного анализа и, тщательно перемешивая, прибавляют 315,3 мг формиата аммония. Содержимое переносят в мерную колбу на 500 см3, доводят водой для лабораторного анализа до метки и перемешивают. Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 — 8 °C не более 1 месяца.
9.3.2. Приготовление водного раствора формиата аммония (20 ммоль NH4HCO2) и гексансульфоновой кислоты (5 ммоль).
Для приготовления раствора формиата аммония NH4HCO2 с концентрацией 20 ммоль и гексансульфоновой кислоты с концентрацией 5 ммоль в стакан объемом 1000 см3 отмеряют 800 см3 воды для лабораторного анализа и, тщательно перемешивая, прибавляют 1261,2 мг формиата аммония и 941,2 мг натриевой соли гексансульфоновой кислоты. Содержимое переносят в мерную колбу на 1000 см3, доводят водой для лабораторного анализа до метки и перемешивают. Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 — 8 °C не более 1 месяца.
9.3.3 Подготовка образцов сухих БАД к пище и СПП к анализу.
Содержимое 5 капсул извлекают из оболочки, 5 таблеток измельчаются в ступке, берется навеска 1 г усредненного образца. Навеску образца помещают в мерную колбу на 50 см3, добавляют 40 см3 смеси метанол — вода (50 : 50). Экстракцию проводят на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 15 мин, затем доводят до метки смесью метанол — вода (50 : 50), перемешивают. Отбирают 1,5 см3 экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 5000 g. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ <1>.
<1> В случае высоких концентраций синефрина из объема V (50 см3) отбирают 5 см3 аликвоты и разбавляют смесью метанол — вода (50 50) в № раз. Разбавление учитывают в конечной формуле расчета концентрации.
9.3.4 Подготовка образцов жидких БАД к пище и СПП к анализу.
К 5 см3 аликвоты образца добавляют 5 см3 метанола, перемешивают. Отбирают 1,5 см3 экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 5000 g. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ <2>.
<2> В случае высоких концентраций синефрина из объема пробы отбирают 5 см3 аликвоты и разбавляют смесью метанол — вода (50 50) в № раз Разбавление учитывают в конечной формуле расчета концентрации
X. Проведение измерений
10.1 Параметры используемых методик.
10.1.1 Условия проведения ион-парной ОФ ВЭЖХ-ДМД.
Условия проведения ОФ ВЭЖХ-ДМД приведены в таблице 5.
Условия проведения измерений ВЭЖХ-ДМД
| Параметр | Значение |
| Насос | |
| - Состав подвижной фазы <*> | A — водный раствор формиата аммония 20 ммоль и гексансульфоновой кислоты 5 ммоль B — ацетонитрил |
| - Режим элюирования | Градиентное элюирование: 0 мин — 0% B, 20 мин — 30% B, 21 мин — 0% B 30 мин — 0% B |
| - Скорость потока | 1,0 см3/мин |
| Инжектор | |
| - Объем ввода | 0,010 см3 |
| Термостат колонок | |
| - Температура | 40 °C |
| Детектирование | ДМД при \lambda = 224\text{нм} и \lambda = 272\text{нм} |
| Хроматографические характеристики методики | |
| - Примерное время удерживания октопамина, tR | 12,5 +/- 0,2 мин |
| - Примерное время удерживания синефрина, tR | 13,4 +/- 0,2 мин |
| Примечание: <*> При необходимости допускается корректировка соотношения компонентов подвижной фазы с целью обеспечения удовлетворительного разрешения | |
10.1.2 Условия проведения ВЭЖХ-МС.
Условия детектирования ВЭЖХ-МС приведены в табл. 6.
Условия проведения измерений ВЭЖХ-МС
| Параметр | Значение |
| Насос | |
| - Состав подвижной фазы <*> | A — водный раствор формиата аммония 10 ммоль B — ацетонитрил |
| - Режим элюирования | Градиентное элюирование: 0 мин — 10% B, 13 мин — 20% B, 15 мин — 20% B, 16 мин — 10% B, 20 мин — 10% B |
| - Скорость потока | 0,5 см3/мин |
| Рабочие параметры: | |
| Температура колонки, | 40 °C |
| Объем вводимой пробы | 0,005 см3 |
| Сканирование масс | |
| - Источник ионизации | Прогреваемый электроспрей |
| - Режим ионизации | Регистрация положительных ионов |
| - Диапазон детектируемых масс веществ | 100 — 500 Да |
| - Детектируемые массы, Да | Синефрин: 168 [M + H]+, 150 [M — H2O + H]+ Октопамин: 154 [M + H]+, 136 [M — H2O + H]+ |
| - Напряжение на капилляре | 3,5 кВ |
| - Поток газа-осушителя (азот) | 10,0 л/мин |
| - Температура газа | 350 °C |
| Хроматографические характеристики методики | |
| - Примерное время удерживания октопамина, tR | 7,7 +/- 0,2 мин |
| - Примерное время удерживания синефрина, tR | 8,7 +/- 0,2 мин |
| Примечание: <*> При необходимости допускается корректировка соотношения компонентов подвижной фазы и параметров источника ионов с целью обеспечения удовлетворительных разрешения и чувствительности. | |
10.2 Идентификация синефрина и октопамина.
Идентификацию синефрина и октопамина осуществляют путем сравнения с абсолютным временем удерживания, УФ-спектрами и массами соответствующих стандартов (рис. 2 - 7).
Рис. 2. УФ-хроматограмма смеси стандартов синефрина и октопамина при \lambda = 224\text{нм}
Рис. 3. Спектр поглощения синефрина
Рис. 4. Спектр поглощения октопамина
Рис. 5. МС-хроматограмма смеси стандартов синефрина и октопамина вверху — полный ионный ток, внизу — выделенные ионы октопамина m/z 136,16 и синефрина m/z 168,16
Рис. 6. Масс-спектр октопамина
XI. Обработка результатов измерений
11.1 Расчет содержания синефрина и октопамина в образцах.
Расчет содержания в образце синефрина и октопамина в твердых образцах проводят по формуле:
X_{\text{фенол}} = \frac{\text{С}_{\text{фенол}}V_{x}N}{m_{\text{навески}}1000} , где
X — количество синефрина или октопамина в образце, мг/г;
C — концентрация стандарта синефрина или октопамина, найденная по калибровочному графику, мг/см3;
V — объем раствора пробы, см3;
N — коэффициент разбавления образца;
mнавески — навеска образца, взятая на анализ, г.
Расчет содержания в образце синефрина и октопамина в жидких образцах проводят по формуле:
X — количество синефрина или октопамина в образце, мг/см3;
C — концентрация стандарта синефрина или октопамина, найденная по калибровочному графику, мг/см3;
2 — разведение образца метанолом;
N — коэффициент разбавления образца.
XII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2|X_{1} - X_{2}|100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где
X1, X2 — результаты параллельных определений, мг/г (мг/см3);
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 \cdot \sigma r .
При превышении расчетного значения предела повторяемости (r) измерение следует провести заново, используя свежеприготовленную пробу.
XIII. Оформление результатов
13.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta) , мг/г (мг/см3), при вероятности P = 0,95, где
\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/г (мг/см3),
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/г (мг/см3);
\Delta = \frac{\delta\overline{X}}{100} , где
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «Содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/г (мг/см3)».
XIV. Контроль качества результатов измерений
14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6 (1 — 6). Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.
Библиографические ссылки
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
3. ГОСТ 1770 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
4. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
5. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования (ИСО 835-1-81)».
6. ГОСТ Р 58144 «Вода дистиллированная. Технические условия».
7. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия (ИСО 3696)».
8. ГОСТ 28311 «Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний».
9. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6) «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
10. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
11. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
12. ГОСТ 12.4.009 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
13. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».