МУК 4.1.3696-21. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой концентрации фитазы в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 02.06.2021)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 2 июня 2021 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ФИТАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3696-21
1. Разработаны ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России (Н.И. Шеина), ООО «Алгама» НИЦ «Экос» (Н.П. Сергеюк).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 2 июня 2021 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации фитазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,5 — 10,0 мг/м3.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Роспотребнадзора, а также могут быть использованы в лабораториях промышленных предприятий при осуществлении контроля за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны, научными и другими организациями, осуществляющими исследования за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны.
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. Характеристика вещества
2.1. Фитазы (мио-инозитол-1,2,3,4,5,6-гексакисфосфат-фосфогидролазы) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз и подклассу фосфатаз, осуществляющих высвобождение хотя бы одного фосфат-иона из молекулы фитиновой кислоты. В результате гидролиза фитиновой кислоты образуются низшие, т.е. содержащие менее шести остатков фосфорной кислоты, инозитолфосфаты, инозитол и неорганический фосфат, а также высвобождаются связанные с фитатами катионы.
В соответствии с Международной номенклатурой ферментов IUPAC-IUBMB различают три типа фитаз: 3-фитазы, 5-фитазы и 4/6-фитазы. Фитазы различных типов начинают трансформацию фитиновой кислоты с гидролиза эфирной связи при различных атомах углерода инозитольного кольца, в результате чего образуются различные изомеры низших инозитолфосфатов.
2.2. Физико-химические свойства фитазы. Фитаза активностью 50 000 ед/г получена путем глубинного культивирования штамма-продуцента дрожжевого гриба Komagataella (Pichia) pastoris ВКПМ Y-4225. Фитаза — мелкокристаллический порошок желтовато-зеленоватого цвета со слабым запахом, хорошо растворим в воде. Содержание фермента — не менее 98% в пересчете на сухое вещество. Агрегатное состояние в воздухе — аэрозоль.
2.3 Токсикологическая характеристика фитазы:
- является активной субстанцией препарата «Фитаза», для получения которого фермент смешивается с пшеничной мукой в соотношении 1 : 2;
- препарат «Фитаза» является малотоксичным веществом при введении в желудок (4-й класс опасности по ГОСТ 12.1.007), обладает слабым раздражающим действием на слизистые оболочки глаз, слабо кумулирует в организме, обладает общетоксическим действием.
III. Метрологические характеристики
3.1. При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой при выполнении измерений массовой концентрации фитазы метрологические характеристики не превышают значений, представленных в табл. 1, (при доверительной вероятности P = 0,95).
Метрологические характеристики методики
IV. Метод измерений
4.1. Измерение массовой концентрации фитазы выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием. Метод основан на разделении фитазы и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом, с последующей регистрацией фитазы с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации фитазы.
Измерение проводят при длине волны 195 нм.
Отбор проб проводят с концентрированием на аналитические аэрозольные фильтры.
Минимально определяемое содержание фитазы в анализируемом объеме раствора пробы — 0,01 мкг.
Нижний предел измерений массовой концентрации фитазы в воздухе 0,5 мг/м3 (при отборе 20 дм3 воздуха).
Метод специфичен в условиях приготовления препаративных форм на основе фитазы. Измерению не мешают вспомогательные вещества (пшеничная мука).
V. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
5.1 Средства измерений
| Хроматограф жидкостной с градиентной системой элюирования, автосэмплером, ультрафиолетовым детектором и с термостатом колонки | |
|---|---|
| Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, диапазон взвешивания по шкале 1 — 100 мг, цена деления шкалы 1 мг, погрешность взвешивания по шкале +/- 0,2 мг | ГОСТ OIML R 76-1 |
| Аспирационное устройство двухканальное с диапазоном расхода 0,5 — 5 дм3/мин и пределом допустимой погрешности +/- 5% | ТУ 4215-000-11696625 |
| Колбы мерные 2-50-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Пипетки 1-1-2-1, 1-1-2-2, 1-1-2-5, 1-1-2-10 | ГОСТ 29227 |
| Пробирки мерные с пришлифованными пробками П-2-10-14/23 ХС | ГОСТ 1770 |
| Цилиндры мерные 3-500 | ГОСТ 1770 |
| Микрошприц вместимостью 0,01 см3 | ГОСТ 8043 |
Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
5.2 Реактивы
| Фермент фитаза с содержанием основного вещества не менее 98% в пересчете на сухое вещество, активность 50 000 ед./г, СОП № 1 от 05.2017 | |
|---|---|
| Ацетонитрил осч (для ВЭЖХ UV 200 нм) | ТУ 6-09-14-2167 |
| Кислота ортофосфорная хч, 85%-й раствор, плотность 1.698 г/см3 | ГОСТ 6552 |
| Вода осч | ТУ 6-09-2502 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ Р 58144 |
Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.
5.3 Вспомогательные устройства и материалы
| Колонка аналитическая размером 250 мм x 4,6 мм, заполненная сорбентом с размером частиц 5,0 мкм, например, Zorbax C 18 | |
|---|---|
| Фильтры аналитические аэрозольные гидрофильные на основе ацетилцеллюлозы с площадью рабочей поверхности 20 см2 | ТУ 95-1892 |
| Фильтродержатели | ТУ 95.72.05 |
| Мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм | ТУ 9471-002-10471723 |
| Бюксы стеклянные СВ 24/10 | ГОСТ 25336 |
| Палочки стеклянные | ГОСТ 25336 |
| Воронки химические | ГОСТ 25336 |
| Дистиллятор | ГОСТ Р 50444 |
| Шкаф сушильный | ТУ 61-1-721 |
Примечание. Допускается применение оборудования, вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
VI. Требования безопасности
6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007, ГОСТ 12.1.005.
6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.0.004. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004.
6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.
6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов <1>.
<1> СанПиН 1.2.3685-21 «Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания».
VII. Квалификация оператора
7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VIII. Условия измерений
8.1 Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:
| - температура воздуха | - (20 +/- 5) °C; |
|---|---|
| - атмосферное давление | - (84 — 106) кПа; |
| - относительная влажность воздуха | - не более 80%. |
8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
IX. Подготовка к выполнению измерений
9.1. Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, контроль стабильности градуировочной характеристики, отбор проб воздуха.
9.2. Приготовление основного раствора фитазы: основной раствор фитазы с массовой концентрацией 500 мкг/см3 готовят растворением (0,05 +/- 0,0002) г фитазы в воде (осч) в мерной колбе вместимостью 100 см3. Срок хранения раствора — не более 3 суток в холодильнике при температуре плюс 4 °C.
9.3. Приготовление рабочего раствора фитазы № 1: рабочий раствор фитазы с массовой концентрацией 200 мкг/см3 готовят разбавлением 20,0 см3 основного раствора фитазы в мерной колбе вместимостью 50 см3 водой (осч).
Срок хранения раствора — не более суток в холодильнике при температуре плюс 4 °C.
9.4. Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 150 см3 ацетонитрила, 1,2 см3 ортофосфорной кислоты (хч) и доводят объем в колбе до метки водой (осч).
Срок хранения раствора в герметичной стеклянной посуде — не более месяца в холодильнике при температуре плюс 4 °C.
9.5. Подготовку хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.
Установление градуировочной характеристики
9.6. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания фитазы в анализируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной градуировки по шести сериям измерений по пяти концентрациям вещества в каждой серии и контрольного раствора № 0 согласно табл. 2.
Растворы для установления градуировочной характеристики при определении фитазы
| Номер (N) градуировочного раствора | Объем рабочего раствора с концентрацией фитазы 200 мкг/см3, см3 | Содержание фитазы на фильтре, мкг | Массовая концентрация фитазы в градуировочном растворе, мкг/см3 | Содержание фитазы в анализируемом объеме градуировочных растворов, мкг |
| 0 <*> | 0,00 | 0,0 | 0,0 | 0,00 |
| 1 | 0,05 | 10,0 | 1,0 | 0,01 |
| 2 | 0,10 | 20,0 | 2,0 | 0,02 |
| 3 | 0,20 | 40,0 | 4,0 | 0,04 |
| 4 | 0,40 | 80,0 | 8,0 | 0,08 |
| 5 | 0,50 | 100,0 | 10,0 | 0,1 |
| Примечание: <*> — контрольный раствор. Срок хранения градуировочных растворов — не более трех дней в холодильнике при температуре плюс 4 °C | ||||
На аналитические аэрозольные фильтры, помещенные в бюксы, пипеткой вместимостью 1 см3 наносят рабочий раствор фитазы с массовой концентрацией 200 мкг/см3 в соответствии с табл. 2. Фильтры подсушивают при комнатной температуре и с помощью пипетки вместимостью 5 см3 приливают по 5 см3 воды особо чистой и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтры тщательно отжимают, растворы сливают в мерные пробирки вместимостью 10 см3. Фильтры повторно обрабатывают 5,0 см3 воды особо чистой и оставляют на 15 минут периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтры тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в те же пробирки и доводят объем раствора до 10,0 см3 водой особо чистой. Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы. Аналогично обрабатывается чистый аналитический аэрозольный фильтр (контрольный раствор № 0 (табл. 2)).
Инжектируют в хроматограф по 0,01 см3 каждого из градуировочных растворов (табл. 2) с помощью микрошприца.
По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика (приборные единицы) от содержания фитазы в анализируемом объеме градуировочных растворов (мкг).
9.7 Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб:
| - длина волны детектора | - 195 нм; |
|---|---|
| - объем вводимой пробы | - 0,01 см3; |
| - температура термостата колонки | - 20 °C; |
| - расход подвижной фазы (см. п. 9.4) | - 0,6 см3/мин; |
| - время удерживания фитазы | - (3,75 +/- 0,15) минуты. |
Контроль стабильности градуировочной характеристики
9.8. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа (после ремонта и поверки прибора).
Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.
Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества по п. 9.6 (соответствующих началу, середине и концу диапазона измерений) и анализируют в точном соответствии с методикой.
Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:
\frac{|S_{\text{изм}} - S_{\text{гр}}|}{S_{\text{гр}}} \cdot 100 \leq \text{К}_{\text{гр}} , где (1)
Sизм, Sгр — значение площади пика (приборные единицы) фитазы в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;
Кгр — норматив контроля, \text{К}_{\text{гр}} = 0,5 \cdot \delta , где
\pm \delta — границы относительной погрешности, % (табл. 1).
Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное хроматографирование этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.
Если градуировочная характеристика нестабильна (условие (1) не выполняется для двух или более образцов градуировочных растворов), выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов (табл. 2) для установления градуировочной характеристики, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики ее устанавливают заново.
9.7. Отбор проб проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005 и приложения 9 к Р 2.2.2006-05 «Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда».
Одновременно отбирают две пробы. При отборе проб фиксируется температура воздуха и атмосферное давление.
Воздух с объемным расходом 2 дм3/мин аспирируют через аналитический аэрозольный фильтр, помещенный в фильтродержатель. Для определения массовой концентрации фитазы на уровне 0,5 мг/м3 (1/2 ОБУВ) необходимо отобрать не менее 20 дм3 воздуха в течение 10 минут. Отобранные пробы можно хранить в бюксах в течение 3 суток в холодильнике при температуре плюс 4 °C.
X. Выполнение измерения
10.1. Аналитический аэрозольный фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, приливают 5,0 см3 воды (осч) и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в мерную пробирку вместимостью 10 см3. Фильтр повторно обрабатывают 5,0 см3 воды особо чистой, оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтр тщательно отжимают и удаляют. Раствор сливают в ту же пробирку, объем раствора доводят до 10 см3 водой особо чистой. Далее раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу.
Хроматографический анализ проб выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.
Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.
Установление содержания фитазы (в мкг) в анализируемом объеме пробы проводят по градуировочной характеристике (п. 9.6).
Примечание. Фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в воде вспомогательных веществ, входящих в состав препаративных форм фитазы.
XI. Вычисление результатов измерений
11.1 Массовую концентрацию фитазы в воздухе рабочей зоны C, мг/м3, вычисляют по формуле:
C = \frac{\text{а} \cdot B}{\text{б} \cdot V_{20}} , где (2)
а — содержание фитазы в анализируемом объеме раствора пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;
B — общий объем раствора пробы, см3;
б — анализируемый объем раствора пробы, см3;
V20 — объем воздуха, отобранный для анализа, приведенный к условиям в соответствии с ГОСТ 8.395 при температуре 293 °К (20 °C) и атмосферном давлении 101,3 кПа (760 мм рт. ст.), дм3.
За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:
\frac{2 \cdot |C_{1} - C_{2}| \cdot 100}{(C_{1} + C_{2})} \leq r , где (3)
C1, C2 - результаты параллельных определений массовой концентрации фитазы в воздухе рабочей зоны, мг/м3;
r — значение предела повторяемости, % (табл. 1).
Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики измерений.
XII. Оформление результатов анализа
12.1 Результат количественного химического анализа представляют в виде:
\overline{C} \pm 0,01 \cdot \delta \cdot \overline{C} , при P = 0,95, где
\overline{C} — среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/м3;
\pm \delta — границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).
Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: «Массовая концентрация фитазы менее 0,5 мг/м3 (более 10 мг/м3)».
XIII. Контроль результатов измерений
Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости
13.1 Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:
а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;
б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сравнительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).
Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.
Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD0,95 по формуле:
\frac{2 \cdot |C_{\text{ср}1} - C_{\text{ср}2}| \cdot 100}{(C_{\text{ср}1} + C_{\text{ср}2})} \leq CD_{0,95} , где (4)
Cср1, Cср2 — средние значения массовой концентрации фитазы, полученные в первой и второй лабораториях, мг/м3;
CD0,95 — значение критической разности, % (табл. 1).
Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в п. 5.3.3 ГОСТ Р ИСО 5725-6.
При разногласиях руководствуются п. 5.3.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.
Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории
13.2. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6.
Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.
При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.