МУК 4.1.3665-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение синтетических красителей методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 29.10.2020)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 октября 2020 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ КРАСИТЕЛЕЙ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3665-20
1. Разработаны ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (В.Ю. Ананьев, О.В. Андросова, А.А. Гарбузова, М.В. Зароченцев, А.А. Константинов, И.П. Семенова, И.С. Шумилина, М.М. Дударев).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 октября 2020 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) для определения синтетических пищевых красителей (далее — СПК) в пищевой продукции в диапазоне 5 — 600 мг/кг.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. Метод измерений
2.1. Методика основана на определении вещества методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
III. Метрологические характеристики
3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Значения характеристики погрешности, нормативов оперативного контроля точности, повторяемости, воспроизводимости
Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.
Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20)
IV. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
4.1 Средства измерений и вспомогательные устройства
| Весы лабораторные | ГОСТ OIML R 76-1; |
|---|---|
| Жидкостной хроматограф с диодно-матричным детектором, имеющим возможность работы в диапазоне длин волн 190 — 800 нм | |
| Спектрофотометр для регистрации спектров поглощения жидких сред в диапазоне длин волн 200 — 800 нм | |
| Колонка хроматографическая размером 250 x 4,6 мм, заполненная заполненные силикагелем с октадецильной группой (C18, ODS) с размером частиц 5 мкм, с колонкой защитной (предколонкой) | |
| Центрифуга лабораторная, обеспечивающая скорость вращения не менее 7000 об./мин с функцией охлаждения камеры ротора до 4 °C | |
| Установка для фильтрации и дегазации жидкостей | |
| Баня ультразвуковая, обеспечивающая нагрев ванны не менее 50 °C | |
| Шейкер орбитальный | |
| Пипетки градуированные 2-1-2, 2-5-2, 2-10-2 см3 по ГОСТ 29227 и/или дозаторы переменного объема 100 — 1000 мм3, 1 — 5 см3 | ГОСТ 28311 |
| Колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Цилиндры мерные вместимостью 25 см3 2-го класса точности исполнений 2 или 2а | ГОСТ 1770 |
| Фильтры мембранные шприцевые нейлоновые с объемом пор 0,45 мкм, диаметром 13 мм | |
| Шприц медицинский вместимостью 5 см3 | |
| многократного применения | ГОСТ 22967 |
| или однократного применения | ГОСТ ISO 7886-1 |
| Пробирки полимерные центрифужные конические с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 см3 | |
| Пробирки полимерные объемом 2 см3 | |
| Стаканы любого типа исполнения вместимостью 50 см3, 100 см3 | ГОСТ 25336 |
4.2 Реактивы
| Тартразин (E102) с массовой долей основного вещества не менее 70,0% | |
|---|---|
| Желтый «солнечный закат» FCF (E110) с массовой долей основного вещества не менее 70,0% | |
| Желтый хинолиновый (E104) с массовой долей основного вещества не менее 70,0% | |
| Синий патентованный V (E131) с массовой долей основного вещества не менее 70,0% | |
| Понсо 4R (E124) с массовой долей основного вещества не менее 70,0% | |
| Красный очаровательный AC (E129) с массовой долей основного вещества не менее 70,0% | |
| Индигокармин (E132) с массовой долей основного вещества не менее 70,0% | |
| азорубин (E122) с массовой долей основного вещества не менее 70,0% | |
| Бриллиантовый голубой FCF (E133) с массовой долей основного вещества не менее 70,0% | |
| Ацетонитрил, осч для ВЭЖХ | |
| Аммоний уксуснокислый, хч | ГОСТ 3117 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ Р 52501 |
Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам, а также посуды, реактивов и материалов, по качеству не хуже вышеуказанных.
V. Требования безопасности
5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
5.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
5.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы в химической лаборатории, освоившие данную методику и подтвердившие экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля точности измерений.
VI. Отбор проб
6.1. Отбор проб пищевой продукции проводят с учетом требований нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта.
VII. Условия проведения измерений
7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия: температуре воздуха от 15 °C до 25 °C, относительная влажность не более 80% (условия измерений должны соответствовать требованиям, изложенным в паспортах или иных документах на используемое оборудование и материалы).
VIII. Подготовка к выполнению измерений
8.1 При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы:
8.2. Подготовка посуды и реактивов: используемую для отбора, хранения и измерения проб посуду сначала ополаскивают водопроводной водой, далее моют небольшим количеством концентрированной серной кислоты, затем тщательно промывают водопроводной водой, чтобы избавиться от следов кислоты, ополаскивают не менее трех раз водой по ГОСТ Р 52501 и ацетонитрилом для ВЭЖХ.
8.3 Приготовление растворов.
8.3.1 Раствора ацетата аммония с концентрацией 100 ммоль/дм3.
Взвешивают (7,70 +/- 0,01) г ацетата аммония, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, растворяют в дистиллированной воде, доводят объем водой до метки и перемешивают. Перед использованием раствор дегазируют и фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Срок годности полученного раствора — не более трех дней при условии визуального отсутствия нерастворимых веществ.
8.4 Приготовление градуировочных растворов.
8.4.1. Основной раствор смеси СПК (100 мг/дм3) готовят, взвешивая по (0,025 +/- 0,001) г каждого СПК, переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3 и доводят до метки водой.
Полученный раствор необходимо хранить при температуре от 2 до 8 °C — не более двух-трех недель.
8.4.2 Рабочие градуировочные растворы.
Из основного раствора смеси СПК в мерную колбу отбирают аликвоту в соответствии с табл. 3, доводят до метки водой и перемешивают. Градуировочные растворы используют свежеприготовленными.
Приготовление градуировочных растворов
8.4.3. Значение массовой концентрации каждого СПК определяют по приготовленным рабочим растворам с помощью спектрофотометра. Отдельно для каждого СПК готовят индивидуальные растворы с массовой концентрацией 100 мг/дм3, которые затем разбавляют — для красителей тартразин (E102), желтый «солнечный закат» FCF (E110), желтый хинолиновый (E104), азорубин (E122) и индигокармин (E132) используют рабочие растворы массовой концентрации 10 мг/дм3, для красителей понсо 4R (E124), красный очаровательный AC (E129), синий патентованный V (E131) и бриллиантовый голубой FCF (E133) — растворы массовой концентрации 1 мг/дм3.
С использованием спектрофотометра регистрируют спектр поглощения соответствующего рабочего раствора красителя относительно воды в диапазоне длин волн 200 — 800 нм. По значению оптической плотности в максимуме поглощения (табл. 4) вычисляют фактическое значение массовой концентрации рабочего раствора Cраб, мг/дм3, по формуле:
C_{\text{раб}} = \frac{1000 \cdot A \cdot M}{\epsilon \cdot L} , где (1)
1000 — коэффициент перевода граммов в миллиграммы;
A — оптическая плотность раствора красителя в максимуме поглощения;
M — молярная масса красителя (см. табл. 6), г/моль;
\epsilon — молярный коэффициент поглощения красителя (см. табл. 6), моль-1·см-1·дм3;
L — толщина слоя раствора в кювете, см.
Фактическое значение массовой концентрации СПК в исходном растворе Cисх, мг/дм3 вычисляют по формуле:
Cраб — фактическое значение массовой концентрации рабочего раствора красителя, вычисленное по формуле (1), мг/дм3;
Kразб — коэффициент разбавления индивидуального раствора красителя при приготовлении рабочего раствора по п. 8.4.3.
Молярная масса и молярный коэффициент поглощения СПК
8.5 Установление градуировочной характеристики.
8.5.1. Для построения градуировочной характеристики осуществляют не менее 3 параллельных измерений градуировочных растворов. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации СПК в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 градуировочным растворам.
8.5.2 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале каждой новой серии проб, используя свежеприготовленный градуировочный раствор № 4. Результаты контроля стабильности градуировочной характеристики признаются удовлетворительными при выполнении условия:
|Xизм — Ccm| <= 0,01·G·Ccm, где (3)
Xизм — результат измерения массовой концентрации данного СПК в контрольных растворах, мг/дм3;
Ccm — фактическое значение массовой концентрации данного СПК в контрольных растворах, мг/дм3 (млн-1);
G — норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, %.
Во всем диапазоне градуировочной характеристики G = 10%. При невыполнении условия (3) градуировочную характеристику устанавливают заново во всем диапазоне измерений.
IX. Проведение измерений
9.1 Условия хроматографирования.
9.1.1. Разделение СПК проводят на обращенно-фазовых хроматографических колонках. Для разделения и идентификации СПК используют градиентный режим элюирования с использованием в качестве подвижной фазы раствора ацетата аммония (CH3COONH4) молярной концентрацией 100 ммоль/дм3 (фаза А) и ацетонитрила (фаза Б) (табл. 5).
Условия градиентного элюирования СПК
| Время анализа, мин | Подвижная фаза А — ацетата аммония, % | Подвижная фаза Б — ацетонитрил, % |
|---|---|---|
| 0,00 | 100,0 | 0,0 |
| 1,00 | 100,0 | 0,0 |
| 35,00 | 65,0 | 35,0 |
| 40,00 | 96,0 | 4,0 |
| 41,00 | 100,0 | 0,0 |
- температура термостата колонки — 30 °C;
- диапазон длин волн детектирования — от 90 до 800 нм;
- объем вводимой пробы — от 5 до 20 мм3;
- скорость потока — 1,00 см3/мин;
- режим элюирования — градиентный.
Детектирование СПК проводят при следующих длинах волн:
- тартразин (E102) — 420 нм;
- желтый «солнечный закат» FCF (E110) — 500 нм;
- желтый хинолиновый (E104) — 420 нм;
- азорубин (E122) — 510 нм;
- понсо 4R (E124) — 510 нм;
- красный очаровательный AC (E129) — 510 нм;
- синий патентованный V (E131) — 620 нм;
- индигокармин (E132) — 620 нм;
- бриллиантовый синий FCF (E133) — 620 нм.
9.2 Подготовка проб.
9.2.1. Навеску измельченного и гомогенизированного пищевого продукта массой (3,00 +/- 0,01) г помещают в полипропиленовую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 50 см3. Добавляют 20,0 см3 дистиллированной воды, нагретой до 50 °C. Пробирку встряхивают на шейкере в течение 5 минут, затем помещают на ультразвуковую баню и выдерживают при температуре 50 °C в течение 15 минут. Далее пробирку с пробой центрифугируют в течение 20 минут при оборотах не менее 7000 об./мин и температуре +4 °C. После центрифугирования аккуратно отбирают 2,0 см3 водной фазы пропускают через нейлоновый фильтр объемом пор 0,2 мкм и используют для хроматографического анализа. При анализе каждой пробы проводят два параллельных измерения.
9.3 Выполнение измерений.
9.3.1. Подготовленную пробу вводят в инжектор хроматографа и регистрируют хроматограмму при условиях п. 9.1. На хроматограмме идентифицируют каждый СПК и по градуировочной характеристике вычисляют значения массовой концентрации красителей.
Если измеренное значение массовой концентрации одного или нескольких СПК в подготовленной пробе находится за пределами диапазона градуировочной характеристики (п. 8.4.2), то необходимо разбавить исходную пробу водой бидистиллированной, так, чтобы массовая концентрация СПК в полученном растворе находилась в середине диапазона градуировочной характеристики, но не более чем в 100 раз. Коэффициент разбавления (Q) вычисляют по формуле:
Q = \frac{V_{\text{р}}}{V_{\text{а}}} , где (4)
Vр — объем разбавленной пробы, см3;
Vа — объем аликвотной порции подготовленной пробы, взятой для разбавления, см3.
X. Обработка результатов измерений
10.1 Массовую концентрацию СПК в пробе X, мг/кг, вычисляют по формуле:
X = \frac{\text{с}_{\text{изм}} \cdot m_{\text{общ}}}{m_{X}} \cdot Q , где (5)
cизм — массовая концентрация красителя в растворе пробы, подготовленной по п. 9.2 (принимают численно равной измеренному по п. 9.3 значению массовой концентрации соответствующего СПК в этой пробе), млн-1
mобщ — общая масса анализируемой пробы с добавкой воды (п. 9.2), г;
mX — масса анализируемой пробы;
Вычисления проводят до второго десятичного знака. Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.
XI. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
11.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (6)
X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 \cdot \sigma_{r} .
При невыполнении условия (6) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XII. Оформление результатов
12.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг при вероятности P = 0,95, где
\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг.
\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} , где (7)
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
XIII. Контроль качества результатов измерений
13.1. Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.
Библиографические ссылки
1. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
2. ГОСТ 12.1.005 «Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны».
3. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
4. ГОСТ 12.1.010 «Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования».
5. ГОСТ 12.1.018 «Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования».
6. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
7. ГОСТ 12.4.009 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
8. ГОСТ 12.4.021 «Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования».
9. ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания.
10. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
11. ГОСТ Р ИСО 5725-6 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
12. ГОСТ ISO/IEC 17025 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий».
13. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы. Основные параметры и размеры».
14. ГОСТ 28311 «Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний».
15. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».