МУК 4.1.3660-20. 4.1. Методы контроля химических факторов. Определение остаточных количеств бензовиндифлупира в горохе и семенах подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 27.10.2020)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 27 октября 2020 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ БЕНЗОВИНДИФЛУПИРА В ГОРОХЕ И СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3660-20
1. Разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, Л.Г. Бондарева).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 27 октября 2020 г.
I. Область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) для определения в горохе и семенах подсолнечника концентрации бензовиндифлупира в диапазоне 0,01 — 0,20 мг/кг.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими исследования в области безопасности и качества пищевой продукции и продовольственного сырья.
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические свойства
2.1. Характеристика вещества и основные физико-химические свойства представлены в табл. 2.1.
Характеристика вещества, основные физико-химические свойства
| Вещество, химическое наименование <1> | Брутто-формула, молекулярная масса | Температура плавления, °C | Растворимость в воде, г/дм3 (20 — 25 °C) |
Коэффициент распределения н-октанол-вода (logKow) |
|---|---|---|---|---|
| Бензовиндифлупир N-[(1RS, 4SR)-9-(дихлорметилен)-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-металнафтален-5-ил]-3-(дифторметил)-1-метилпиразол-4-карбоксамид | C18H15Cl2F2N3O, 398,2 |
148,4 +/- 0,5 | 0,0001 (pH 6,7 — 7,5) |
4,3 +/- 0,3 (25 °C, pH 6,59) |
<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).
III. Погрешность измерений
3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности p = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1, для соответствующих диапазонов концентраций (согласно ГОСТ Р ИСО 5725).
Значения характеристики погрешности, нормативов оперативного контроля точности, повторяемости, воспроизводимости
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 3.2.
Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20)
IV. Метод измерений
4.1 Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором.
4.2. Экстракцию бензовиндифлупира из анализируемых проб гороха и семян подсолнечника выполняют смесью ацетонитрила и воды с добавлением 1 см3 ледяной уксусной кислоты, центрифугированием, очисткой экстракта на картридже, заполненным сорбционным материалом на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола.
4.3. Нижний предел измерения бензовиндифлупира в анализируемом объеме пробы — 1 нг. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, термостатом колонки | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Прибор/приборы для измерения атмосферного давления, температуры и относительной влажности воздуха | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности 0,0005 г | ГОСТ Р 53228 |
| Меры массы | ГОСТ OIML R 111-1 |
| Пробоотборное устройство 2-канальное с диапазонами расхода 0,2 — 1,0 дм3/мин и 5,0 — 1,0 дм3/мин | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 100, 500 и 1000 см3 | ГОСТ 1770-74 |
| Мерные колбы вместимостью 25, 100, 500 и 1000 см3 | ГОСТ 1770 |
| Весы аналитические с пределом взвешивания 110 г и пределом допустимой погрешности 0,001 г | ГОСТ Р 53228 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 1770 |
Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Бензовиндифлупир | Аналитический стандарт с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Ацетонитрил для ВЭЖХ | Чистота не менее 99,9% |
| Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная или деионизованная) | ГОСТ Р 52501 |
| Калий углекислый (карбонат калия, поташ) химически чистый прокаленный | ГОСТ 4221 |
| Метиловый спирт (метанол) химически чистый | ГОСТ 6995 |
| Уксусная кислота 99,5 чистая для анализа | ГОСТ 61 |
| Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид фосфора) | Химически чистый |
Примечание: допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки.
Вспомогательные устройства, материалы
Примечание: допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовые хроматографы.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
6.3. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VII. Условия измерений
7.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
VIII. Подготовка к выполнению измерений
8.1 Очистка растворителей.
8.1.1. Ацетонитрил. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм3 ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм3 ацетонитрила 10 г карбоната калия). Хранят в емкости из темного стекла.
8.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 650 см3 ацетонитрила и 350 см3 бидистиллированной или деионизованной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.
Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 30 дней.
8.3 Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ.
Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 8.2) при скорости подачи растворителя 1,0 см3/мин до установления стабильной базовой линии.
8.4 Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.
8.4.1. Исходный раствор бензовиндифлупира для градуировки (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,0100 +/- 0,0005 г бензовиндифлупира, добавляют 50 — 70 см3 ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится в холодильнике (+2 — 6 °C) не более 9 месяцев.
Растворы № 1 — 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.
8.4.2. Раствор № 1 бензовиндифлупира для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см3).
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10 см3 исходного раствора бензовиндифлупира (п. 8.4.1) с концентрацией 100 мкг/см3, разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор № 1 хранится в холодильнике (+2 — 6 °C) не более 6 месяцев.
8.4.3. Рабочие растворы № 2 — 6 бензовиндифлупира для градуировки (концентрация 0,05 — 1,0 мкг/см3). В 5 мерных колб вместимостью 100 см3 помещают 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 и 10,0 см3 рабочего раствора № 1 с концентрацией 10,0 мкг/см3 (п. 8.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 6 с концентрациями бензовиндифлупира 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1,0 мкг/см3.
Растворы хранят в холодильнике при температуре +2 — 6 °C не более трех месяцев.
8.5 Приготовление смесей органических растворителей для экстракции.
8.5.1 Смесь ацетонитрил-вода = 8:2 (по объему).
В мерную колбу на 500 см3 вносят 400 см3 ацетонитрила и 100 см3 бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.
8.5.2 Смесь ацетонитрил-вода = 2:8 (по объему).
В мерную колбу на 500 см3 вносят 100 см3 ацетонитрила и 400 см3 бидистиллированной воды. Тщательно перемешивают.
8.6 Подготовка картриджа для очистки и концентрирования экстракта.
Картридж устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума. Промывают картридж последовательно 1 см3 метанолом, 1 см3 ацетонитрилом, затем три раза по 1 см3 смесью ацетонитрил-вода, в соотношении 2:8 по объему, приготовленной по п. 8.5.2. Процедуру проводят с использованием вакуума. Скорость элюирования 15 — 20 капель в минуту. Не допускать высыхания верхнего слоя сорбента в картридже.
Не допускать высыхания верхнего слоя сорбента в картридже.
8.7 Установление градуировочной характеристики.
Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации бензовиндифлупира в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.
В инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных ниже. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков бензовиндифлупира, на основании которых строят градуировочную зависимость.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух градуировочных растворов, содержание бензовиндифлупира в которых должно входить в диапазон линейности градуировочной характеристики от 0,05 до 1 мкг/см3.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
A = \frac{|(X - C) \cdot 100|}{C} \leq B,
где X — концентрация бензовиндифлупира в пробе при контрольном измерении, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора бензовиндифлупира, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
B — норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).
IX. Отбор и условия хранения проб
9.1. Отбор проб производится в соответствии с методическими документами <2>.
<2> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов от 21.08.1979 № 2051; «Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности». Москва, 2018. 64 с.
Пробы зерна гороха хранят в холодильнике при температуре +2 — 6 °C не более 4 дней. Пробы семян подсолнечника подсушивают и хранят при комнатной температуре не более 2 недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.
X. Выполнение определения
10.1 Подготовка образцов к измерению.
Образец измельченных зерен гороха или семян подсолнечника массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 см3. Добавляют 100 см3 смеси растворителей ацетонитрила и воды в соотношении 8:2, приготовленной в соответствии с п. 8.5.1. Перемешивают. Оставляют в покое на 15 минут. После чего добавляют 1 см3 ледяной уксусной кислоты и помещают на встряхиватель на 30 минут. Раствор декантируют и фильтруют через неплотный бумажный фильтр. Осадок в колбе заливают 30 см3 смеси ацетонитрил-вода (8:2), приготовленной согласно п. 8.5.1. Экстрагируют в течение 15 минут на встряхивателе. После отстаивания раствор фильтруют через неплотный бумажный фильтр. Фильтраты объединяются и переносятся в круглодонную колбу объемом 250 см3. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C до водного остатка (15 — 20 см3). Водный остаток пропускают через подготовленный в соответствии с п. 8.6 картридж со скоростью 15 — 20 капель в минуту, используя разряжение, создаваемое водоструйным насосом. После пропускания пробы картридж четыре раза по 1 см3 промывают смесью ацетонитрил-вода в соотношении 2:8, приготовленной в соответствии с п. 8.5.2. Бензовиндифлупир элюируют с картриджа ацетонитрилом 2 раза по 1 см3. Элюат собирают в круглодонную колбу объемом 50 см3. Упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 30 °C до влажного остатка. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрил-вода в соотношении 8:2, приготовленной в соответствии с п. 8.5.1. Перед хроматографированием пробу дополнительно фильтруют через мембранный фильтр.
10.2 Условия хроматографирования.
Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:
- жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором и термостатом колонки;
- хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми алкильными группами (C-18 или C-8) для удерживания гидрофильных соединений, зернением 5 мкм;
- рабочая длина волны 254 нм;
- температура колонки 25 °C;
- подвижная фаза ацетонитрил-бидистиллированная вода (65:35, по объему);
- скорость потока элюента 1,0 см3/мин;
- объем вводимой пробы 20 мм3;
- линейный диапазон детектирования 1 — 20 нг.
XI. Обработка результатов анализа
11.1 Содержание бензовиндифлупира в пробах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:
где V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г;
C — концентрация бензовиндифлупира, найденная по градуировочному графику в соответствии с площадью хроматографического пика, мкг/см3;
Примечание. Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.
XII. Оформление результатов
12.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг, мг/дм3 при вероятности P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг, мг/дм3;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг.
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.
Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «Содержание бензовиндифлупира в пробе (горох, семена подсолнечника) — менее 0,01 мг/кг» <3>.
<3> 0,01 мг/кг — предел обнаружения бензовиндифлупира в горохе, семенах подсолнечника.
XIII. Контроль качества результатов измерений
13.1. Организация контроля качества результатов определения осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6).
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки C_{\text{д}} должна удовлетворять условию:
C_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л}.X} + \Delta_{\text{л}.X\prime},
где \Delta_{\text{л}.X}( \pm \Delta_{\text{л}.X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,
где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
\text{К}_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - C_{\text{д}},
где \overline{X}\prime , \overline{X} , C_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л}.X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л}.X}^{2}} .
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости R:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R,
где X1, X2 - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6) «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
2. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания»
3. ГОСТ OIML R 111-1 «Государственная система обеспечения единства измерений».
4. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
5. ГОСТ 20490 «Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия».
6. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
7. ГОСТ 4221 «Реактивы. Калий углекислый. Технические условия».
8. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
9. ГОСТ 9737 «Посуда лабораторная стеклянная. Шлифы сферические взаимозаменяемые».
10. ГОСТ 21241 «Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний».
11. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
12. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
13. ГОСТ 12.1.018 «Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования».
14. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
15. ГОСТ 12.4.009 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
16. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
17. ГОСТ 27570.46 «Безопасность бытовых и аналогичных электрических приборов. Дополнительные требования к измельчителям пищевых отходов и методы испытаний».
18. ГОСТ 26678 «Холодильники и морозильники бытовые электрические».
19. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов № 2051-79 от 21.08.79.
20. Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности. Москва, 2018. 64 с.