МУК 4.1.3629-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств хлормекват-хлорида в зерне и соломе зерновых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 05.08.2020)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 5 августа 2020 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ХЛОРМЕКВАТ-ХЛОРИДА В ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3629-20
1. Разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, В.В. Баюшева, М.С. Гречина, Л.В. Горячева).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 5 августа 2020 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) для определения в зерне и соломе зерновых культур массовой концентрации хлормекват-хлорида в диапазонах 0,125 — 1,25 мг/кг и 0,25 — 2,5 мг/кг, соответственно.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими исследования в области безопасности и качества пищевой продукции и продовольственного сырья.
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические и токсикологические свойства
2.1. Хлормекват-хлорид — 2-хлорэтил(триметил)азаниум; хлорид <1>. Брутто формула C5H13Cl2N. Молекулярная масса 158,07. Белое кристаллическое гигроскопичное вещество, хорошо растворимо в воде, спиртах и некоторых других органических растворителях, практически нерастворимо в углеводородах. Агрегатное состояние в воздушной среде — аэрозоль. Температура плавления — 225 °C.
<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).
2.2. Острая пероральная токсичность (LD50) для кроликов — 115 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для кроликов — 964 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC50) для крыс — более 5,2 мг/м3.
2.3. Используется в качестве ретарданта для обработки пшеницы, для ускорения начала плодоношения груш и яблонь, для ограничения роста усов и повышения урожайности земляники, для повышения урожайности виноградной лозы, белокочанной капусты и т.д.
III. Погрешность измерений
3.1. При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности p = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 и 3.2 для соответствующих диапазонов концентраций.
Значения характеристики погрешности, нормативов оперативного контроля точности, повторяемости, воспроизводимости
3.2. Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20)
IV. Метод измерений
4.1. Методика основана на определении вещества с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором (далее — ВЭЖХ-МС/МС).
4.2. Экстракцию вещества из анализируемых проб растительной продукции выполняют метанолом и очищают, пропуская через патрон для твердофазной экстракции.
4.3. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки. Нижний предел измерения хлормекват хлорида в анализируемом объеме пробы — 0,125 нг.
V. Средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Приборы/прибор для измерения атмосферного давления, температуры и влажности воздуха | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Весы аналитические, с пределом допустимой погрешности +/- 0,0001 г | ГОСТ Р 53228 |
| Весы лабораторные общего назначения с пределом допустимой погрешности +/- 0,01 г | ГОСТ Р 53228 |
| Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь, снабженный автоматическим пробоотборником и термостатом колонки | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 50 и 100 см3 | ГОСТ 1770 |
| Меры массы | ГОСТ OIML R 111-1 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0 и 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 10, 25, 50, 100, 250 и 500 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр с диапазоном измерений от 0 °C до 55 °C и ценой деления 0,1 °C | ГОСТ 28498 |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Хлормекват-хлорид | Аналитический стандарт с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Азот особой чистоты, из баллона | ГОСТ 9293 (ИСО 2435-73) |
| Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная или деионизованная) | ГОСТ Р 52501 |
| Метиловый спирт (метанол), химически чистый | ГОСТ 6995 |
| Муравьиная кислота, 99,7%, чистая для анализа | ГОСТ 5848 |
| Аммоний муравьинокислый (формиат аммония), 99,0% | Чистый для анализа |
Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
Вспомогательные средства измерений, устройства, материалы
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.
6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать нормы и правила <2>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.
<2> Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением, утвержденные приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 № 116.
6.4. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VII. Условия измерений
7.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на газовых хроматографах проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
VIII. Подготовка к выполнению измерений
8.1 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.
Компонент А: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 500 см3 деионизированной воды, вносят 1,2 г формиата аммония и 0,1 см3 муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.
Компонент Б: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 500 см3 метанола, вносят 0,1 см3 муравьиной кислоты, доводят до метки метанолом, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.
Каждый компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.
8.2. Приготовление смеси растворителей для рабочих растворов и разбавления проб. В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 500 см3 метанола, 0,6 г формиата аммония, 0,1 см3 муравьиной кислоты, доводят до метки 500 см3 деионизованной воды, перемешивают. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.
8.3 Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.
8.3.1. Исходный раствор хлормекват-хлорида для градуировки (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,0100 г хлормекват-хлорида, добавляют 50 — 70 см3 метанола, перемешивают, доводят метанолом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранятся в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более 3 месяцев.
Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.
8.3.2. Раствор № 1 хлормекват-хлорида для градуировки и внесения (концентрация 5 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 5 см3 исходного раствора хлормекват-хлорида (п. 8.3.1) с концентрацией 100 мкг/см3, доводят до метки метанолом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор № 1 с концентрацией хлормекват-хлорида 5 мкг/см3. Раствор № 1 хранится в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более одного месяца.
8.3.3. Рабочие растворы № 2 — 5 хлормекват-хлорида для градуировки (концентрация 0,025 — 0,25 мкг/см3). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают 5, 2, 1 и 0,5 см3 градуировочного раствора № 1 с концентрацией хлормекват-хлорида 5 мкг/см3 (п. 8.3.2), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 8.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией хлормекват-хлорида 0,25, 0,1, 0,05 и 0,025 мкг/см3, соответственно. Растворы хранятся в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более двух недель.
8.4. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ. Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 8.1, в соотношении 1 : 1) при скорости подачи растворителя 0,2 см3/мин до установления стабильной базовой линии.
8.5 Установление градуировочной характеристики.
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (I) от концентрации хлормекват-хлорида в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.
В инжектор хроматографа вводят по 5 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
8.6 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание хлормекват-хлорида в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,025 до 0,250 мкг/см3.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
A = \frac{(X - C)}{C} \cdot 100 \leq B , где
X — концентрация хлормекват-хлорида в пробе при контрольном измерении, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора хлормекват-хлорида, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
B — норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 20% при P = 0,95).
Если величина расхождения (A) превышает 20%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов хлормекват-хлорида, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 8.5.
IX. Отбор и хранение проб
9.1. Отбор проб осуществляется в соответствии с действующими методическими документами <3>.
<3> ГОСТ 13586.3 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб».
9.2. Пробы зерна и соломы подсушивают и хранят при комнатной температуре не более 2 недель. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C.
X. Выполнение определения
10.1 Экстракция зерна и соломы зерновых культур.
Образец измельченного зерна массой 5 г или соломы массой 2,5 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 см3. Вносят 60 см3 метанола, выдерживают 5 минут на ультразвуковой ванне. Надосадочную жидкость сливают в новую плоскодонную колбу вместимостью 250 см3. Повторяют экстракцию, используя 40 см3 метанола, выдерживают 5 минут на ультразвуковой ванне. Экстракты объединяют и перемешивают.
Отбирают часть экстракта объемом 40 см3 в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, пробу центрифугируют в течение 10 мин при скорости вращения 8500 оборотов/мин. Аликвоту экстракта объемом 20 см3 упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35 °C.
10.2. Очистка экстракта. Остаток растворяют в 5 см3 раствора, приготовленного по п. 8.2, выдерживают 1 — 2 минуты на ультразвуковой ванне. Далее пробу пропускают через патрон для твердофазной экстракции. Первые 1 — 1,5 см3 элюата отбрасывают, последующие собирают в виалу. При необходимости пробу дополнительно пропускают через мембранный фильтр (размер пор 0,2 мкм) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.2.
10.2 Условия хроматографирования.
Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:
- жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов;
- источник ионизации — электростатическое распыление;
- режим работы — регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация «перехода»): материнский ион (масса/заряд) 123,1; дочерние ионы (масса/заряд) 59,2 (количественный расчет), 63,0; напряжение на фрагментаторе 126 В; энергия разрушения (соударения) 30 В (123,1 \rightarrow 59,2) , 9 В (123,1 \rightarrow 63,0) ; скорость сканирования 200 мс; давление на распылителе 35 psi;
- скорость осушающего газа 1 (азот) 10 дм3/мин; температура газа 1 325 °C; скорость газа 2 (азот) 12 дм3/мин; температура газа 2 400 °C; температура квадруполей (1 и 3) 100 °C;
- хроматографическая колонка стальная длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм; температура колонки 30 °C; скорость потока элюента 0,2 см3/мин; объем вводимой пробы 5 мм3;
- подвижная фаза: 20 мМ раствор формиата аммония и 0,01% муравьиной кислоты в воде : 0,01% раствор муравьиной кислоты в метаноле (65 : 35, по объему).
- линейный диапазон детектирования 0,125 — 1,25 нг.
Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,25 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).
XI. Обработка результатов анализа
11.1 Содержание хлормекват-хлорида в пробах зерна и соломы зерновых культур (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:
X = \frac{A \cdot V_{\text{кон}} \cdot C \cdot 100}{m \cdot f} , где
A — концентрация хлормекват-хлорида, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см3;
Vкон — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г;
C — коэффициент, учитывающий объема экстракта, взятого для анализа, C = 5.
f — полнота извлечения вещества, выраженная в относительных единицах (величину полноты извлечения, приведенную в табл. 2, разделить на 100).
XIII. Оформление результатов
13.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг при вероятности P = 0,95, где
\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.
Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «Содержание хлормекват-хлорида в пробе зерна и соломы зерновых культур — менее 0,125 мг/кг и 0,25 мг/кг, соответственно» <4>.
<4> 0,125 мг/кг и 0,25 мг/кг — пределы обнаружения хлормекват-хлорида в пробе зерна и соломы зерновых культур, соответственно.
XIII. Контроль качества результатов измерений
13.1 Организация контроля качества измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:
\text{С}_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime} , где
\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой) мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
\text{К}_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - \text{С}_{\text{д}} , где
\overline{X}\prime , \overline{X} , Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг;
Норматив контроля К рассчитывают по формуле
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}}
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов параллельных определений.
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , где (1)
X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 \cdot \sigma_{r} .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Библиографические ссылки
1. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6) «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
2. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
3. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
4. ГОСТ 28498 «Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний».
5. ГОСТ 1770 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
6. ГОСТ OIML R 111-1 «Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования».
7. ГОСТ 9293 (ИСО 2435) «Азот газообразный и жидкий. Технические условия».
8. ГОСТ 13586.3 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб».
9. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
10. ГОСТ 20490 «Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия».
11. ГОСТ 6995 «Реактивы. Метанол-яд. Технические условия».
12. ГОСТ 5848 «Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия».
13. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
14. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
15. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
16. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная безопасность. Общие требования».
17. ГОСТ 12.4.009 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
18. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
19. Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением, утвержденные приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 № 116.