МУК 4.1.3603-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика определения сибутрамина в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 24.07.2020)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 24 июля 2020 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИБУТРАМИНА В БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВКАХ К ПИЩЕ И СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОЙ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3603-20

Методические указания разработаны ФГБУН «Федеральный исследовательский центр питания и биотехнологии» (В.А. Тутельян, К.И. Эллер, И.Б. Перова, А.М. Суханова).

I. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) регулируют порядок определения сибутрамина в биологически активных добавках (далее — БАД) к пище и специализированной пищевой продукции (далее — СПП) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) с УФ-спектрофотометрическим детектированием на диодной матрице (далее — ДМД) и масс-спектрометрическим (далее — МС) детектированием.

1.2. МУК распространяются на исследования недекларированного добавления синтетического ингибитора обратного захвата серотонина и норадреналина — сибутрамина — в БАД к пище и СПП, в диапазоне от 0,01 до 20 мг/г.

1.3. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящихся в обращении на территории Российской Федерации, в том числе импортируемых в Российскую Федерацию, а также могут быть использованы другими испытательными лабораториями (центрами), осуществляющими контроль качества и безопасности биологически активных добавок к пище и продукции пищевой специализированной, аккредитованными в установленном порядке.

1.4 МУК носят рекомендательный характер.

II. Общие положения

2.1. Тривиальное название — сибутрамин. 1-(1-(4-хлорофенил)циклобутил)-N,N,2,2-тетраметилпропан-1-амин <1>.

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

Структурная формула вещества представлена на рис. 1.

Рис. 1. Структурная формула сибутрамина

Сибутрамин — лекарственный препарат, предназначенный для проведения комплексной поддерживающей терапии больных с избыточной массой тела при алиментарном ожирении с индексом массы тела от 30 кг/м2 и более или с индексом массы тела от 27 кг/м2 и более, но при наличии других факторов риска, обусловленных избыточной массой тела (сахарный диабет типа 2, дислипопротеидемия), и являющийся ингибитором обратного захвата нейромедиаторов — серотонина и норадреналина.

Данный фармацевтический препарат рекомендуется применять по назначению врача после сбора полного анамнеза и проведения тщательного общеклинического обследования и для исключения взаимодействия с другими принимаемыми пациентом фармацевтическими препаратами, такими как ингибиторы изофермента CYP3A4, селективные ингибиторы обратного захвата серотонина, рифампицин, карбамазепин, дексаметазон, макролидные антибиотики, фенитоин, фенобарбитал.

Существует проблема фальсификации, связанная с возможным недекларированным добавлением сибутрамина в БАД и СПП.

2.2. Физические свойства: сибутрамин представляет собой кристаллический порошок от белого до кремового цвета. Растворимость в воде: 2,9 мг/мл при pH 5,2. Коэффициент распределения (октанол/вода): 30,9 (pH 5,0). Брутто формула C17H26ClN. Молярная масса сибутрамина составляет 279,85 г/моль, сибутрамина гидрохлорида моногидрата — 334,33 г/моль.

УФ-спектр сибутрамина в метаноле характеризуется максимумом поглощения при длине волны 225 нм.

III. Погрешность измерений

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

IV. Метод измерений

4.1. Методика основана на определении сибутрамина в метанольном экстракте образца с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ со спектрофотометрическим ДМД и подтверждением структуры с помощью МС. Идентификацию сибутрамина проводят по совпадению времени удерживания, данным УФ-спектрофотометрии и МС. Количественное определение проводится по данным ВЭЖХ-УФ методом внешней калибровки.

V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

5.1. Средства измерений

5.2. Вспомогательное оборудование

5.3. Реактивы и материалы

Примечание. Допускается использование средств измерения, оборудования, питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными или лучшими характеристиками.

VI. Требования при проведении испытаний

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-2017, а также требования, изложенные в технической документации к прибору.

6.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалистов, имеющих высшее или среднее специальное образование и опыт работы в химическо-аналитической лаборатории, владеющих методом ВЭЖХ.

VII. Отбор проб

7.1. Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией по отбору проб для определения токсичных элементов для каждого конкретного вида продукции.

VIII. Условия измерений

8.1 При проведении измерений соблюдаются следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

IX. Подготовка к выполнению измерений

9.1. Измерениям предшествуют следующие операции: приготовление стандартных и градуировочных растворов, приготовление растворов для экстракции, приготовление подвижной фазы, подготовка проб для анализа.

9.2. Приготовление раствора хранения стандарта сибутрамина. Навеску сибутрамина около 10 мг (далее — точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 10 см3, добавляют 8 см3 метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем — до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентраций 1 мг/мл.

Приготовленный раствор хранят при температуре 4 — 8 °C в течение 6 месяцев.

9.3. Приготовление градуировочных рабочих растворов стандарта сибутрамина. Для получения разбавленных калибровочных растворов сибутрамина с концентрацией 0,01; 0,1 мг в мл в ряд колб вместимостью 10 см3 помещают 0,1 см3 и 1 см3 раствора хранения стандарта сибутрамина и доводят объем раствора до 10 см3 метанолом.

Приготовленный раствор хранят при температуре 4 — 8 °C в течение не более 2 недель.

Далее строят градуировочный график по трем концентрациям 0,01; 0,1; 1 мг/мл зависимости оптической плотности (A) калибровочных растворов от концентрации сибутрамина (мг/см3) A = f(C). По градуировочному графику с учетом разбавления вычисляют содержание сибутрамина в пробе.

9.4 Приготовление подвижной фазы.

9.4.1. Приготовление 0,05 М формиатного буфера pH = 4,0. Для приготовления раствора формиата аммония NH₄HCO₂ с концентрацией 10 ммоль в стакан объемом 500 см3 отмеривают 400 см3 воды для лабораторного анализа и, тщательно перемешивая, прибавляют 1575 мг формиата аммония. Содержимое переносят в мерную колбу вместимостью 500 см3, доводят водой для лабораторного анализа до метки и перемешивают. Доводят значение pH до 4 с помощью pH-метра.

9.4.2. Приготовление водного раствора формиата аммония (0,01 М NH₄HCO₂). Для приготовления раствора формиата аммония NH₄HCO₂ с концентрацией 10 ммоль в стакан объемом 500 см3 отмеривают 400 см3 воды для лабораторного анализа и, тщательно перемешивая, прибавляют 315 мг формиата аммония. Содержимое переносят в мерную колбу вместимостью 500 см3, доводят водой для лабораторного анализа до метки и перемешивают.

9.5. Подготовка образца к анализу (БАД). Содержимое 5 капсул извлекают из оболочки, берется навеска усредненного образца в 1,0 г. После взвешивания навеску пробы помещают в мерную колбу вместимостью 25 см3, добавляют 25 см3 метанола. Экстракцию проводят на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 10 мин. Отбирают 1,5 см3 экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 5000 g. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ.

9.6. Подготовка образца к анализу (продукция пищевая специализированная). Навеску 1 г образца помещают в мерную колбу вместимостью 25 см3, добавляют 15 см3 метанола. Экстракцию проводят на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 10 мин. Доводят объем до метки метанолом и перемешивают. Отбирают 1,5 см3 экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 5000 g. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ.

В случае высоких концентраций сибутрамина из объема V (100 см3) отбирают аликвоту в 10 см3 и разбавляют метанолом в № раз. Разбавление учитывают в конечной формуле расчета концентрации.

X. Проведение измерений

10.1 Параметры используемых методик.

10.1.1. Условия проведения ВЭЖХ с использованием диодно-матричного спектрофотометрического детектора. Условия проведения ВЭЖХ приведены в табл. 2.

Таблица 2

Условия проведения ВЭЖХ

<*> При необходимости допускается корректировка соотношения компонентов подвижной фазы с целью обеспечения удовлетворительного разрешения.

10.1.2. Условия проведения ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Условия детектирования на масс-спектрометрическом детекторе приведены в табл. 3.

Таблица 3

Условия детектирования на масс-спектрометрическом детекторе

10.2 Идентификация сибутрамина.

Идентификацию сибутрамина осуществляют путем сравнения с абсолютным временем удерживания, УФ-спектрами и массами соответствующего стандарта (рис. 2 - 5).

Рис. 2. УФ-хроматограмма стандарта сибутрамина, \lambda = 225\text{нм}

Рис. 3. Спектр поглощения сибутрамина

Рис. 4. МС-хроматограмма сибутрамина: вверху — полный ионный ток, внизу — выделенный ион сибутрамина m/z 280

Рис. 5. Масс-спектр протонированного иона сибутрамина

10.3 Обработка результатов измерения. Расчет содержания в образце сибутрамина проводят по формуле:

X = \frac{S_{\text{сиб}} \times C \times V \times N}{m_{\text{навески}} \times S_{\text{стд}}} ,

где X — количество сибутрамина в образце, мг/г;

Sсиб — площадь пика сибутрамина в образце, полученная с помощью УФ-спектрофотометрического детектора;

Sстд — площадь пика сибутрамина в стандарте, полученная с помощью УФ-спектрофотометрического детектора;

V — объем раствора пробы, см3;

C — концентрация стандарта сибутрамина, найденная по калибровочному графику, мг/см3;

mнавески — навеска образца, взятая на анализ, г;

N — коэффициент разбавления пробы.

Результат анализа представляют в виде:

(\text{Х } \pm \Delta)\text{мг}/\text{г} при вероятности P = 0,95,

где X — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/г;

\Delta = \frac{\delta \cdot \text{Х}}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/г».

10.4 Обработка результатов измерения.

10.4.1. Проверка приемлемости результатов параллельных определений. Определение содержания сибутрамина в каждом образце проводится в 2 параллельных измерениях. Вывод о допустимости расхождения между параллельными измерениями определяют на основании предела повторяемости (r) по формуле:

\frac{2 \cdot |\text{Х}_{1} - \text{Х}_{2}| \cdot 100}{(\text{Х}_{1} + \text{Х}_{2})} \leq r,

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/г.

При превышении расчетного значения предела повторяемости (r), измерение следует провести заново, используя свежеприготовленную пробу.

XI. Оформление результатов

11.1 Результат анализа представляют в виде:

(\dot{\text{Х}} \pm \Delta),\text{мг}/\text{г}, при вероятности P = 0,95,

где \dot{\text{Х}} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/г;

\Delta — граница абсолютной погрешности методики.

XII. Контроль качества результатов измерений

12.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности и показателя правильности.