МУК 4.1.3557-19. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение фикотоксинов азаспирацидов в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС). Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 09.10.2019)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 9 октября 2019 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИКОТОКСИНОВ АЗАСПИРАЦИДОВ В МОРЕПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В СОЧЕТАНИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ АНАЛИЗОМ (ВЭЖХ-МС)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3557-19

1. Методические рекомендации разработаны ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» и ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (В.А. Тутельян, Д.Б. Никитюк, С.А. Хотимченко, О.В. Багрянцева, П.В. Кудан, И.Е. Соколов, А.Д. Мусаева, Е.В. Елизарова.

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 09 октября 2019 г.

3. Введены впервые.

I. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методику определения фикотоксинов азаспирацидов в морепродуктах на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС).

1.2. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3 Методические указания носят рекомендательный характер.

II. Общие положения

2.1. Азаспирациды относятся к группе липофильных фикотоксинов. Продуцируются морскими водорослями рода Azadinium (A. spinosum, A. poporum, A. dexteroporum). В настоящее время известно более 30 производных азаспирацидов. Наиболее значимыми в отношении токсического действия являются азаспирациды AZA-1, AZA-2 и AZA-3.

Азаспирациды обладают свойствами нейротоксичности, цитотоксичности, канцерогенности (являются причиной развития опухолей легких и злокачественной лимфомы) и кардиотоксичности. Азаспирациды вызывают повреждение цитоскелета, активируют апоптоз гепатоцитов (за исключением легких и почек), блокируют кальциевые каналы в клетках. Острая токсическая доза азаспирацидов для человека составляет 0,04 г/кг массы тела. В связи с тем, при попадании в организм небольшого количества токсина отмечаются только неспецифические гастроинтестинальные симптомы, возможна гипо- или гипердиагностика данного пищевого отравления, что, наряду с высокой токсичностью, обусловливает необходимость контроля этого загрязнителя в морепродуктах.

Эмпирическая формула: C₄₇H₇₁NO₁₂.

Молекулярная масса: 841.

Рис. 1. Химическая структура азаспирацидов

Количественный метод определения азаспирацидов при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС) отличается хорошей воспроизводимостью, селективностью, высокой чувствительностью и надежностью, а также отсутствием необходимости использования дериватизации образцов. Нижний предел количественного определения азаспирацидов при использовании предлагаемого способа анализа азаспирацидов составляет 53 мкг/кг.

Максимально допустимый уровень содержания азаспирацидов в моллюсках установлен в Стандарте «Кодекс Алиментариус».

III. Принцип метода

3.1. Метод основан на экстракции азаспирацидов из гомогенизированных тканей морепродуктов раствором метанола с добавлением 0,1%-й муравьиной кислоты и 0,5 мМ ацетата аммония. Количество токсина определяется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС).

IV. Средства измерений, вспомогательные устройства материалы и реактивы

4.1 Средства измерений, вспомогательные

устройства и материалы

4.2 Реактивы

Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, материалов и реактивов с метрологическими и техническими характеристиками не хуже приведенных выше.

V. Требования при проведении испытаний

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.

5.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов <1>.

<1> ГН 2.2.5.3532-18 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны»; ГН 2.2.5.2308-07 «Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны».

Помещение, в котором проводится определение азаспирацидов, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции по подготовке образцов к анализу необходимо проводить в вытяжном шкафу.

Анализ содержания азаспирацидов в подготовленных образцах проводится в специализированном проветриваемом помещении, оснащенном вытяжкой, при температуре не более 20 °C с целью защиты дыхания.

Работа с морепродуктами осуществляется персоналом в рабочей/защитной одежде (халат, защитные очки, перчатки) с целью защиты кожи и глаз. Не допускается утилизация биологических материалов с бытовым мусором, слив жидких биологических образцов в канализацию.

VI. Отбор и подготовка проб

6.1. Отбор морепродуктов для проведения анализа осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 31339.

Отобранные образцы морепродуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки или стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, замораживают и хранят при температуре от -18 °C до -20 °C, используя для этой цели морозильники или соответствующие приспособления.

После извлечения тела моллюска, устрицы, гребешка из раковины его необходимо обсушить для удаления воды. Образцы измельчаются при температуре от 15 °C до 20 °C в приборе для грубого измельчения или при помощи ножниц. Подготовка образцов из этого гомогената может быть произведена либо немедленно после измельчения, либо позднее после повторного перемешивания. Гомогенат может храниться не более недели при температуре от -18 °C до -20 °C в плотно закрытом контейнере.

VII. Подготовка к испытанию

7.1 Приготовление компонентов подвижной фазы для ВЭЖХ

Компонент A: 0,1% (объем) раствор муравьиной кислоты и 0,5 мМ ацетата аммония в воде.

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 30 — 40 см3 дистиллированной воды, вносят 0,1 см3 муравьиной кислоты и 0,004 г ацетата аммония, перемешивают, доводят водой до метки, перемешивают.

Компонент B: ацетонитрил для хроматографии, химически чистый (далее — хч).

7.2 Приготовление матричной градуировки

Для приготовления калибровочных стандартов мясо моллюска, не содержащее азаспирацидов и/или их производных в пределах обнаружения метода, гомогенизируют при помощи скальпеля (блендера). После чего к гомогенату добавляют исходные растворы AZA1-b, AZA2-b, AZA3-b в метаноле (табл. 1) с перемешиванием 1 мин на устройстве типа вортекс. Полученный гомогенат выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, повторно перемешивают 1 мин, разделяют на 5 равных частей по 0,2 г с последующим замораживанием. Для построения градуировочной кривой необходимо не менее 5 контрольных точек. Калибровочные стандарты размораживают по мере необходимости и проводят их пробоподготовку совместно с исследуемыми пробами.

Таблица 1

Пример приготовления калибровочных стандартов

7.3 Приготовление раствора метилового спирта (метанола)

с добавлением 0,1%-й муравьиной кислоты и 0,5 мМ ацетата аммония

Раствор для экстракции: в мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 30 — 40 см3 метилового спирта, вносят 0,1 см3 муравьиной кислоты и 0,004 г ацетата аммония, перемешивают, доводят до метки метиловым спиртом, вновь перемешивают.

VIII. Проведение испытаний

8.1 Подготовка образца для определения азаспирацидов

Образцы мяса семейства морских двухстворчатых моллюсков (устрицы, мидии) измельчают при помощи скальпеля (блендера), навеску гомогенизированного продукта массой 0,2 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 2 см3, вносят 0,8 см3 раствора метилового спирта (п. 7.3) и перемешивают 1 мин на перемешивающем устройстве типа вортекс. Выдерживают 20 мин при комнатной температуре (20 °C) для осаждения белков. Пробу центрифугируют в течение 15 минут с относительным центробежным ускорением 12000g. Аликвоту экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 0,5 см3 с помощью пипеточного дозатора помещают в хроматографическую виалу.

8.2 Условия хроматографирования

Для хроматографического анализа используют жидкостной хроматограф с тандемным масс-спектроскопическим детектором типа «орбитальная ловушка» с источником ионизации, оснащенным насосной подачей горячего азота для эффективной десольватации ионов. Для осуществления масс-спектрометрической детекции используют подключенный к выходу из хроматографической колонки масс-спектрометр высокого разрешения;

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

• источник ионизации: электроспрей;
• режим работы:
• количественный анализ AZA1-b проводится по иону [MH]^{+} с соотношением масса/заряд 842,4608 +/- 0,025 а.е.м; время выхода хроматографического пика 1,61 мин;
• количественный анализ AZA2-b проводится по иону [MH]^{+} с соотношением масса/заряд 856,4763 +/- 0,025 а.е.м; время выхода хроматографического пика 1,95 мин;
• количественный анализ AZA3-b проводится по иону [MH]^{+} с соотношением масса/заряд 828,4466 +/- 0,025 а.е.м; время выхода хроматографического пика 1,12 мин;
• диапазон сканирования: 800 — 900 а.е.м;
• разрешение: 60000;
• напряжение на капилляре электроспрея: 5,5 кВ;
• скорость потока основного газа: 50 относительных единиц;
• скорость потока вспомогательного газа: 10 относительных единиц;
• температура капилляра интерфейса: 250 °C;
• температура испарителя: 500 °C;
• хроматографическая колонка стальная длиной 75 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми гидрофобными группами C18, зернением 3,5 мкм;
• температура колонки: 35 °C;
• скорость потока элюента: 0,8 см3/мин;
• объем вводимой пробы: 0,003 см3;
• режим элюирования (градиентный), пробег 8 мин (табл. 2).

8.3 Режим элюирования

Таблица 2

Режим элюирования

Масс-спектр азаспирацидов AZA1-b, AZA2-b, AZA3-b в положительном режиме представлен на рис. 2.

Рис. 2. Масс-спектр азаспирацидов AZA1-b, AZA2-b, AZA3-b в положительном режиме

8.4 Построение градуировочной кривой

Построение градуировочных кривых проводится по площадям хроматографических пиков стандартных образцов азаспирацидов на хроматограмме EIC (хроматограмма выбранного иона), построенных по соотношению масса/заряд ионов AZA1-b [MH]+ (842,4608 а.е.м.) с шириной окна 0,050 а.е.м; AZA2-b [MH]+ (856,4763 а.е.м.) с шириной окна 0,050 а.е.м; AZA3-b [MH]+ (828,4466 а.е.м.) с шириной окна 0,050 а.е.м. Зависимость квадратичная, взвешивание равное (рис. 3, 4, 5).

Рис. 3. Градуировочная кривая для количественного определения азаспирацида AZA1-b в положительном режиме по иону [MH]+ (условия 842,4608 а.е.м.)

Рис. 4. Градуировочная кривая для количественного определения азаспирацида AZA2-b в положительном режиме по иону [MH]+ (условия 856,4763 а.е.м.)

Рис. 5. Градуировочная кривая для количественного определения азаспирацида AZA3-b в положительном режиме по иону [MH]+ (условия 828,4466 а.е.м.)

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (S., I*сек) от концентрации азаспирацида (AZA1-b, AZA2-b, AZA3-b) в мясе (мкг/кг), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 матричным растворам для градуировки (по п. 7.2).

В инжектор хроматографа вводят 0,003 см3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 8.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Устанавливают площади пиков действующего вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.

8.5 Анализ хроматограммы

Количественный анализ содержания в образце азаспирацидов AZA1-b, AZA2-b, AZA3-b проводится по площади пиков на хроматограмме EIC (хроматограмма выбранного иона), построенных по соотношению масса/заряд иона AZA1-b [MH]+ 842,4608 +/- 0,025 а.е.м. с шириной окна 0,050 а.е.м; AZA2-b [MH]+ 856,4763 +/- 0,025 а.е.м. с шириной окна 0,050 а.е.м; AZA3-b [MH]+ 828,4466 +/- 0,025 а.е.м. с шириной окна 0,050 а.е.м. Градуировочные кривые строились по площадям хроматографических пиков, зависимость квадратичная, взвешивание равное (рис. 6, 7, 8).

Рис. 6. Хроматографический пик азаспирацида AZA1-b в мясе устрицы по иону [MH]+ 842,4608 а.е.м.

Рис. 7. Хроматографический пик азаспирацида AZA2-b в мясе устрицы по иону [MH]+ 856,4763 а.е.м.

Рис. 8. Хроматографический пик азаспирацида AZA3-b в мясе устрицы по иону [MH]+ 828,4466 а.е.м.

IX. Требования к показателям точности измерений

9.1. При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 3

Метрологические характеристики метода

X. Условия проведения измерений

10.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия: температуре воздуха от 15 °C до 20 °C, относительная влажность не более 80% (условия измерений должны соответствовать требованиям, изложенным в паспортах или иных документах на используемое оборудование и материалы).

XI. Обработка результатов измерений

11.1. Содержание азаспирацида 1, азаспирацида 2, азаспирацида 3 (в виде индивидуальных веществ) в пробе (X, мкг/кг) определяют согласно градуировочной кривой (п. 8.4). Расчет содержания азаспирацидов в мясе моллюсков производится из расчета прямой зависимости площади пика аналита от его концентрации в образце. При определении соответствия полученных результатов установленным регламентам безопасности морепродуктов проводится расчет суммы концентраций азаспирацидов (азаспирацида 1, азаспирацида 2, азаспирацида 3) в исследуемом образце моллюсков.

XII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мкг/кг;

r — значение предела повторяемости (табл. 3), при этом r = 2,8\sigma_{r} .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

XIII. Оформление результатов

13.1 Результат анализа по сумме содержания индивидуальных веществ представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta) , мкг/кг, при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мкг/кг

\Delta — граница абсолютной погрешности, мкг/кг;

\Delta = \frac{\delta X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3), %.

XIV. Контроль качества результатов измерений

14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности и показателя правильности.

XV. Требования к квалификации оператора

15.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.