МУК 4.1.3524-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания фипронила и его метаболита фипронил-сульфона в зеленой массе, семенах и масле подсолнечника, зеленой массе, зерне и масле кукурузы методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 декабря 2017 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ИЗМЕРЕНИЕ ОСТАТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ ФИПРОНИЛА И ЕГО МЕТАБОЛИТА ФИПРОНИЛ-СУЛЬФОНА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА, ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ЗЕРНЕ И МАСЛЕ КУКУРУЗЫ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3524-17

Свидетельство об аттестации № 01.00225/205-14-16.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) для определения массовой доли фипронила и его метаболита фипронил-сульфона в зеленой массе, семенах и масле подсолнечника, зеленой массе, зерне и масле кукурузы в диапазоне измерений 0,001 — 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Фипронил

5-Амино-1-(2,6-дихлор- \alpha , \alpha , \alpha -трифтор-п-толил)-4-трифторметилсульфинил-пиразол-3-карбонитрил.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₂H₄Cl₂F₆N₄OS.

Молекулярная масса: 437,2.

Бесцветное кристаллическое вещество с плесневелым запахом. Температура плавления: 195,5 — 203,0 °C. Давление насыщенного пара при 20 °C: 3,7 x 10-7 Па. Растворимость (г/дм3) при 20 °C: вода — (1,9 — 2,4) x 10-3; ацетон — 545,9; этилацетат — 264,9; метанол — 137,5; гексан — 2,8 x 10-3; дихлорметан — 22,3; 1-октанол — 12,2. Фипронил термически стабилен, не разрушается в присутствии металлов. Вещество стабильно в водной среде при pH 5 — 7; при pH 9 гидролизуется на 50% за 28 дней.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс 97 млн-1 (мг/кг); острая ингаляционная токсичность (LC50) для крыс — 682 мг/м3 воздуха (аэрозоль), накожная токсичность (ЛД50) для кроликов — 354 мг/кг. Токсичен для пчел и других полезных насекомых.

Область применения препарата. Фипронил — инсектицид из группы фенилпиразолов контактного, кишечного и частично системного действия с длительным защитным эффектом. Он эффективно подавляет развитие вредителей из отрядов жесткокрылых и прямокрылых в посевах зерновых культур и на плантациях картофеля при норме расхода 5 — 12,5 г д.в./га, а также обитающих в почве вредителей при обработке семян зерновых культур.

В растениях соединение в результате окисления переходит в фипронил-сульфон.

Фипронил-сульфон

(+/-)-5-Амино-1-(2,6-дихлор- \alpha , \alpha , \alpha -трифтор-п-толил)-4-трифторметилсульфонил-пиразол-3-карбонитрил.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₂H₄Cl₂F₆N₄OS₂.

Молекулярная масса: 453,15.

Кристаллический порошок от белого до желтовато-белого цвета. Температура плавления: 200 — 230 °C. Растворимость в воде: <= 1%.

МДУ фипронила (мг/кг) в РФ согласно ГН 1.2.3111-13: картофель — 0,02; зерно хлебных злаков — 0,005; бананы — 0,005 <,**>; подсолнечник (семена) — 0,002 <,>; почки и молоко КРС, яйца, субпродукты птицы, капуста (все виды), печень КРС — 0,1 <*,>; мясо КРС — 0,5 <,**>; рис, кукуруза, мясо птицы — 0,01 <,>; сахарная свекла — 0,2 <*,>. МДУ для масла подсолнечника и масла кукурузы не установлены.

<*,**> — ВМДУ для импортируемой продукции.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Таблица 1

Метрологические характеристики

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Методика основана на определении фипронила и его метаболита фипронил-сульфона с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) после экстракции веществ из анализируемых образцов ацетонитрилом, очистки экстрактов, их концентрирования упариванием в токе азота.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование аналогичных реактивов других производителей или реактивов с более высокой квалификацией.

3.3 Вспомогательные средства измерений,

устройства и материалы

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на систему газовой хроматографии.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на системе жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием, и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на системе газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: подготовка посуды, приготовление смесей солей, приготовление градуировочных растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

7.1 Подготовка посуды

Перед анализом стеклянную посуду обрабатывают деионизированной водой не менее двух раз и сушат при температуре (200 +/- 10) °C,

7.2 Приготовление смесей солей

7.2.1 Приготовление смеси солей № 1

В центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 помещают (4,0 +/- 0,2) г сульфата магния безводного, (1,0 +/- 0,05) г хлорида натрия, (1,0 +/- 0,05) г натрия лимоннокислого тризамещенного двойного гидрата, (0,5 +/- 0,03) г натрия лимоннокислого двузамещенного полуторного гидрата. Смесь готовят непосредственно перед проведением анализа.

7.2.2 Приготовление смеси солей № 2а

(для очистки экстрактов зерна кукурузы, зеленой массы подсолнечника, зеленой массы кукурузы)

В центрифужную пробирку вместимостью 15 см3 помещают (0,15 +/- 0,01) г первично-вторичного аминосорбента, (0,9 +/- 0,01) г сульфата магния безводного, (0,015 +/- 0,001) г угля активированного. Смесь готовят непосредственно перед проведением анализа.

7.2.3 Приготовление смеси солей № 2б

(для очистки экстрактов семян подсолнечника, масла подсолнечного, масла кукурузного)

В центрифужную пробирку вместимостью 15 см3 помещают (0,15 +/- 0,01) г первично-вторичного аминосорбента, (0,9 +/- 0,01) г сульфата магния безводного, (0,15 +/- 0,01) г сорбента C18. Смесь готовят непосредственно перед проведением анализа.

7.3 Приготовление градуировочных растворов

7.3.1 Приготовление исходных растворов

7.3.1.1. Основной раствор фипронила (концентрация 1 000 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 25 см3 помещают (0,025 +/- 0,001) г фипронила, добавляют 10 — 15 см3 ацетонитрила, перемешивают и доводят объем до метки этим же растворителем, вновь перемешивают. Раствор хранят при температуре (4 — 6) °C в течение 6 месяцев.

7.3.1.2. Основной раствор фипронил-сульфона (концентрация 1 000 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 25 см3 помещают (0,025 +/- 0,001) г фипронила, добавляют (10 — 15) см3 ацетонитрила, перемешивают и доводят объем до метки этим же растворителем, вновь перемешивают. Раствор хранят при температуре (4 — 6) °C в течение 6 месяцев.

7.3.1.3. Исходный раствор № 1 (концентрация каждого вещества по 10 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,1 см3 основного раствора фипронила (п. 7.3.1.1) и 0,1 см3 основного раствора фипронил-сульфона (п. 7.3.1.2). Разбавляют до метки ацетонитрилом, перемешивают. Раствор хранят при температуре (4 — 6) °C в течение 3 месяцев.

7.3.2 Приготовление градуировочных растворов

7.3.2.1. Рабочий раствор № 2 (концентрация каждого вещества по 0,5 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 5 см3 помещают 0,25 см3 раствора № 1 (п. 7.3.1.3). Доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают. Раствор № 2 готовят непосредственно перед использованием.

7.3.2.2. Рабочие растворы № 3 — 6 (концентрация каждого вещества по 0,005 — 0,1 мкг/см3). В 4 мерные колбы вместимостью 5 см3 помещают по 0,05 см3; 0,1 см3; 0,5 см3 и 1,0 см3 рабочего раствора № 2 (п. 7.3.2.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 3 — 6 с концентрацией фипронила и фипронил-сильфона по 0,005; 0,01; 0,05 и 0,1 мкг/см3 соответственно. Градуировочные растворы № 2 — 6 готовят непосредственно перед использованием.

7.4 Установление градуировочных характеристик

Градуировочную характеристику по каждому аналиту, выражающую зависимость площади пика (УЕИ·с) от концентрации фипронила и фипронил-сульфона в растворах (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной градуировки по 5 градуировочным растворам № 2 — 6 (п. 7.3.2.1 - 7.3.2.2).

В инжектор хроматографа вводят 1 мм3 каждого градуировочного раствора № 2 — 6 и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 2 параллельных измерений. По полученным данным строят градуировочную характеристику.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб проводят в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».

Семена подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в тканевых мешочках в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6 месяцев. Пробы масла (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в холодильнике в течение 3 месяцев. Для длительного хранения измельченные пробы зерна замораживают и хранят при температуре -18 °C.

9. Выполнение определения

9.1 Подготовка проб

Перед началом анализа пробы зерна кукурузы, семян подсолнечника, зеленой массы кукурузы и подсолнечника измельчают и гомогенизируют до однородного состояния при помощи мельницы. Из гомогенизированных проб отбирают две навески для анализа массой 5 г.

9.2 Экстракция фипронила и фипронил-сульфона

Образец измельченной пробы массой 5 г помещают в центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, добавляют 10 см3 деионизированной воды, 10 см3 ацетонитрила, смесь солей № 1 (п. 7.2.1), интенсивно встряхивают (для избежания комкообразования), помещают на аппарат для встряхивания на 1 минуту. Далее пробирки с пробами помещают в центрифугу и центрифугируют 5 минут при 3 000 об./мин. При этом происходит расслаивание водной и ацетонитрильной компоненты раствора. Отбирают надосадочную жидкость (экстракт пробы в ацетонитриле). Экстракты проб семян подсолнечника, подсолнечного или кукурузного масла после центрифугирования для удаления жира вымораживают при температуре не выше -18 °C в течение часа.

9.3 Очистка экстракта

Для очистки экстрактов зерна кукурузы, растений подсолнечника и кукурузы (п. 7.2.2) в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, добавляют смесь солей № 2а, для очистки экстрактов семян подсолнечника, подсолнечного и кукурузного масел добавляют смесь солей № 2б (п. 7.2.3), отбирают и добавляют аликвоту экстракта пробы в ацетонитриле (п. 9.2) объемом 6 мл, встряхивают при помощи встряхивателя в течение 1 минуты, после чего помещают в центрифугу и центрифугируют 5 минут при 3 000 об./мин.

9.4 Концентрирование экстракта

Аликвоту очищенного экстракта (п. 9.3) объемом 3 см3 отбирают в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3 и выпаривают досуха в токе азота при температуре не более 40 °C. К сухому остатку прибавляют 0,3 см3 ацетонитрила и встряхивают при помощи встряхивателя в течение 2 минут. Отбирают в стеклянные флаконы объемом 2 см3 и анализируют на содержание фипронила и фипронил-сульфона по п. 9.5.

9.5 Условия хроматографирования

Измерения проводят при следующих режимных параметрах хроматографической системы.

Газовый хроматограф, оснащенный автоподатчиком, программируемым инжектором, термостатом и масс-селективным детектором (ГХ-МС).

Разделительная хроматографическая колонка — стеклянная капиллярная длиной 25 — 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неполярной неподвижной фазой, толщина пленки неподвижной фазы — 0,25 мкм.

Условия детектирования

Детектор: квадрупольный масс-спектрометр.

Температура интерфейса: 280 °C.

Температура ионного источника: 230 — 250 °C.

Тип ионизации: Электронный удар (EI).

Энергия ионизирующих электронов: 70 эВ.

Тип сканирования: мониторинг индивидуальных ионов (SIM).

Массы основного иона и ионов сравнения C1 и C2 в режиме SIM для определения фипронила и фипронил-сульфона:

Каждый экстракт хроматографируют дважды.

Устанавливают площади пиков вещества, находят среднее значение с помощью градуировочной характеристики, определяют концентрацию фипронила и фипронил-сульфона в хроматографируемом растворе.

Экстракты образцов, при анализе которых площадь пиков больше, чем площадь пика градуировочного раствора № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3, разбавляют ацетонитрилом, но не более чем в 10 раз.

10. Обработка результатов анализа

Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации прибора.

Содержание фипронила или фипронил-сульфона в пробах зеленой массы, семян и масла подсолнечника, зеленой массы, зерна и масла кукурузы (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

X = \frac{C_{\text{фп}(\text{фпс})} \cdot V \cdot 100}{m \cdot e \cdot K} , где (1)

Cфп(фпс) — массовые доли фипронила (фипронил-сульфона) соответственно, найденные по градуировочным графикам, мкг/см3;

V — объем ацетонитрильного экстракта, 10 см3 (п. 9.2);

m — масса анализируемого образца, 5 г (п. 9.2);

K — коэффициент концентрирования пробы, равный 10 (п. 9.4);

e — полнота извлечения, учитывающая все процедуры подготовки пробы, % (табл. 2).

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

\frac{2|X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r, где (2)

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений содержания фипронила или фипронил-сульфона, мг/кг;

r — значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (2) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики измерений.

12. Оформление результатов

Результат расчетов фипронила (фипронил-сульфона) представляют в виде:

\overline{X_{\text{ф }/\text{фс}}} \pm \Delta_{\text{ф }/\text{фс}}, (3)

\Delta_{\text{ф }/\text{фс}} = 0,01 \cdot \delta_{\text{ф }/\text{фс}} \cdot \overline{X_{\text{ф }/\text{фс}}} при P = 0,95, где (4)

\overline{X_{\text{ф }/\text{фс}}} — среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений фипронила или фипронил-сульфона, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta_{\text{ф }/\text{фс}} — погрешность измерения фипронила или фипронил-сульфона;

\pm \delta — границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

В случае если полученный результат измерений массовой доли фипронила (фипронил-сульфона) ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то результат анализа представляют в виде:

«массовая доля фипронила (фипронил-сульфона) менее 0,001 мг/кг».

Окончательный результат анализа представляют в виде эквивалентного содержания нормируемого компонента (фипронила) с учетом содержания его метаболита (фипронил-сульфона), определенного по формуле:

\overline{X_{\text{экв}}} = (\overline{X_{\text{ф}}} + 0,93\overline{X_{\text{фс}}}) \pm \sqrt{\Delta_{\text{ф}}^{2} + \Delta_{\text{фс}}^{2}} . (5)

13. Контроль качества результатов измерений

13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики по каждому из анализируемых компонентов проводят перед каждой серией измерений, анализируя три свежеприготовленных градуировочных раствора № 2 — 4 (0,005; 0,05 и 0,5 мкг/см3), а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией анализируемых компонентов в начале, середине и конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

\frac{|S_{\text{изм}} - S_{\text{гр}}|}{S_{\text{гр}}} \cdot 100 \leq K_{\text{гр}}, где (6)

Sизм, Sгр — значение площади пика фипронила (фипронил-сульфона) в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;

Kгр — норматив контроля, K_{\text{гр}} = 0,5 \cdot \delta ;

\pm \delta — границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

13.2 Внутрилабораторный оперативный контроль

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики проводят по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений», используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02. Проверку стабильности выполняют с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

13.3 Проверка приемлемости результатов измерений

Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD0,95 по формуле:

\frac{2 \cdot |C_{\text{ср}1} - C_{\text{ср}2}| \cdot 100}{(C_{\text{ср}1} + C_{\text{ср}2})} \leq CD_{0,95}, где (7)

Cср1, Cср2 — средние значения массовой доли фипронила (фипронил-сульфона), полученные в первой и второй лабораториях, мг/кг;

CD0,95 — значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.4).

Методические указания разработаны ФГБУ «Федеральный центр оценки безопасности и качества зерна и продуктов его переработки» (В.Л. Сухова, Н.И. Добрева, С.Д. Добрев, Е.С. Горбунов).