МУК 4.1.3510-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств азоксистробина и его метаболита Z-азоксистробина в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 декабря 2017 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АЗОКСИСТРОБИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТА Z-АЗОКСИСТРОБИНА В БОТВЕ И КОРНЕПЛОДАХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3510-17

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, А.А. Далинова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики измерений № 01.5.04.237/01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации азоксистробина и его метаболита Z-азоксистробина в ботве и корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне концентраций 0,05 — 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Азоксистробин

Метил (E)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат (IUPAC).

Структурная формула:

Молекулярная масса: 403,4.

Брутто формула: C₂₂H₁₇N₃O₅.

Бесцветное кристаллическое вещество без цвета и запаха.

Температура плавления: 116 °C. Давление паров: 1,1 x 10-7 МПа (20 °C). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода KowlogP = 2,5 (20 °C).

Растворимость в воде (20 °C): — 6 мг/дм3. Растворимость (г/дм3, 20 °C): в гексане — 0,057, в толуоле — 55, ацетонитриле — 340, метаноле — 20, октаноле — 20, ацетоне — 86. Гидролитически стабилен при комнатной температуре при pH 3 — 10. Фотолиз азоксистробина протекает с образованием Z-изомера.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность для крыс ЛД50 > 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность ЛД50 > 2 000 мг/кг, ингаляционная токсичность ЛК50 > 0,7 мг/м3. Малотоксичен для пчел и шмелей.

Область применения. Фунгицид системного и контактного действия, имеет длительный защитный эффект, высокоэффективен против возбудителей ложной и мучнистой настоящей росы, пятнистости листьев зерновых, ржавчины и корневых гнилей на рисе, томате, картофеле и др.

Z-азоксистробин

Метил (Z)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат (IUPAC).

Структурная формула:

Молекулярная масса: 403,4.

Брутто формула: C22H17N3O5.

Кристаллическое вещество желтого цвета, физико-химические свойства близки к свойствам азоксистробина.

Гигиенические нормативы для азоксистробина в России: МДУ в овощах со съедобными клубнями и корнями (кроме картофеля) — 1,0 мг/кг.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения азоксистробина и Z-азоксистробина, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0,95

2. Метод измерений

Метод основан на определении азоксистробина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов ацетонитрилом в присутствии цитратного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз; очистке ацетонитрильного экстракта с помощью дисперсионной твердофазной экстракции и на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация азоксистробина проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-15.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности «Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением» (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 № 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2 Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции

Патрон промывают 2,5 см3 элюента № 2, затем 3 см3 элюента № 1.

7.3 Приготовление растворов

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в деионизованной воде и доводят объем до метки.

7.4 Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор азоксистробина с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску азоксистробина (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Основной раствор Z-азоксистробина с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску Z-азоксистробина (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.3. Приготовление градуировочных растворов. Градуировочные растворы с концентрациями азоксистробина и Z-азоксистробина 0,05 + 0,05; 0,1 + 0,1; 0,2 + 0,2; 0,5 + 0,5 мкг/см3 соответственно, готовят методом последовательного разбавления по объему, используя подвижную фазу.

7.4.3.1. Раствор № 1 с концентрацией 0,5 + 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,1 см3 основного раствора азоксистробина и 0,1 см3 основного раствора Z-азоксистробина и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.3.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,2 + 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 4,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.3.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,1 + 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.3.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,05 + 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до подвижной фазой.

Основные растворы азоксистробина и Z-азоксистробина можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы — в течение недели.

При изучении полноты определения азоксистробина и Z-азоксистробина используют ацетонитрильные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5 Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация азоксистробина и его метаболита в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации азоксистробина и его метаболита в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

C = КS,

где S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|\text{С } - \text{С}_{\text{к}}|}{\text{С}} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.},

где C — аттестованное значение массовой концентрации азоксистробина в градуировочном растворе;

Cк — результат контрольного измерения массовой концентрации азоксистробина в градуировочном растворе;

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).

7.6 Проверка хроматографического поведения азоксистробина

и его метаболита на патроне для твердофазной экстракции

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора азоксистробина и его метаболита с концентрацией 0,5 + 0,5 мкг/см3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см3 ацетона, добавляют 9 см3 гексана и переносят на подготовленный патрон. Промывают патрон 3 см3 элюента № 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют азоксистробин и его метаболит 10 см3 элюента № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

Фракции, содержащие азоксистробин и его метаболит объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб свеклы производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 52647-06 «Свекла сахарная. Технические условия». Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят до анализа в герметичной полиэтиленовой упаковке.

9. Проведение определения

9.1 Определение азоксистробина и его метаболита в ботве

и корнеплодах свеклы

Навеску измельченной матрицы 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, последовательно добавляют 10 см3 ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния, 1 г хлористого натрия, 1 г цитрата натрия двуводного и 0,5 г динатрия цитрата сесквигидрата. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 5 см3, переносят в центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, содержащую 150 мг смеси первичных и вторичных аминов и 900 мг безводного сульфата магния. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают 1 см3, упаривают досуха в токе воздуха при температуре не более 40 °C. Сухой остаток чистят на патроне для твердофазной экстракции Диапак С (п. 9.2).

9.2 Очистка на патроне для твердофазной экстракции

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.1), растворяют в 1 см3 ацетона, добавляют 9 см3 гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Промывают патрон 3 см3 элюента № 1. Азоксистробин и его метаболит элюируют 5 см3 элюента № 2. Элюат переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см3 и упаривают досуха при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

9.3 Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 45:55. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 245 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание азоксистробина и его метаболита в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = \frac{S_{x} \cdot K \cdot V}{P} ,

где Sx — площадь пика азоксистробина или его метаболита на хроматограмме испытуемого образца (AU);

K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P — навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств азоксистробина и его метаболита в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор азоксистробина с концентрацией 0,05 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r,

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta), мг/кг при вероятности P = 0,95,

где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,05 мг/кг <>, где <> 0,05 мг/кг — предел обнаружения азоксистробина в корнеплодах свеклы).»

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода «добавок».

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime},

где \pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X'}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:

Кк = X' — X - Cд,

где X', X, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} . (1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Кк| <= К, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R, (3)

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.