МУК 4.1.3501-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ацибензолар-C-метила в салате, дыне, томатах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 декабря 2017 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АЦИБЕНЗОЛАР-C-МЕТИЛА В САЛАТЕ, ДЫНЕ, ТОМАТАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3501-17

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации ацибензолар-C-метила в салате, дыне, томатах в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Ацибензолар-C-метил

S-метил бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоксилат (IUPAC).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₈H₆N₂OS₂.

Молекулярная масса: 210,3.

Светло-бежевый порошок. Давление паров: 4,4·10-1 МПа (при 25 °C). Температура плавления: 132,9 °C. Растворимость в органических растворителях (при 25 °C, г/дм3): метанол — 4,2; этилацетат — 25; гексан — 1,3; толуол — 36; ацетон — 28; дихлорметан — 160. Растворимость в воде при 25 °C — 7,7 мг/дм3.

Область применения. Ацибензолар-C-метил — фунгицид химического класса бензотиадиазола, используется для борьбы с рядом инфекционных заболеваний пшеницы на ранней стадии болезни или как профилактическое средство. Эффективен также против ряда заболеваний риса, табака, овощных культур.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Значения характеристики погрешности, нормативов оперативного контроля точности, повторяемости, воспроизводимости

Полнота извлечения ацибензолар-C-метила, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.

Уровни ацибензолар-C-метила в образцах салата, дыни, томатов определяют после его щелочного гидролиза при 65 — 70 °C, очистки с применением картриджа для твердофазной экстракции.

Нижний предел измерения ацибензолар-C-метила в анализируемом объеме пробы — 0,01 нг.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства, материалы

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-15. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности «Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением» (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 № 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к оператору

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка ацетонитрила (при необходимости), приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов, смесей для экстракции, подготовка концентрирующих патронов для очистки экстрактов, приготовление градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики.

7.1 Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм3 ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм3 ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

Компонент А (0,1%-й раствор муравьиной кислоты в воде): в мерную колбу вместимостью 1 000 см3 помещают 500 см3 деионизированной воды, вносят 1,0 см3 муравьиной кислоты, доводят до метки водой, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Компонент Б (метанол): фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Каждый компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

7.3 Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ

Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 7.2, в соотношении 1:1) при скорости подачи растворителя 0,3 см3/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4 Приготовление смесей растворителей для экстракции

и элюирования вещества с патрона, а также для приготовления градуировочных растворов

7.4.1. В мерную колбу вместимостью 1 000 см3 помещают 500 см3 деионизированной воды, вносят 2,0 см3 муравьиной кислоты, доводят до метки водой, перемешивают, получают водный раствор муравьиной кислоты.

7.4.2. В мерную колбу вместимостью 500 см3 помещают 100 см3 деионизированной воды, вносят 20 г гидроксида натрия, доводят до метки водой, перемешивают, получают 1 М водный раствор гидроксида натрия.

7.4.3. В мерную колбу вместимостью 1 000 см3 помещают 100 см3 деионизированной воды, вносят 0,4 г гидроксида натрия, доводят до метки водой, перемешивают, получают 0,01 М водный раствор гидроксида натрия

7.4.4. В мерную колбу вместимостью 250 см3 помещают 100 см3 метанола, вносят 2,5 см3 1 М водного раствора гидроксида натрия, доводят до метки метанолом, перемешивают, получают 0,01 М раствор гидроксида натрия.

7.4.5. В мерную колбу вместимостью 500 см3 помещают 200 см3 метанола, вносят по каплям 5 см3 37%-й соляной кислоты, добавляют 300 см3 метанола, перемешивают, получают 1%-й раствор соляной кислоты.

Растворы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

7.5 Подготовка концентрирующих патронов

Концентрирующие патроны с использованием медицинского одноразового шприца промывают со скоростью прохождения растворителя 1 — 2 капли в секунду: последовательно 5 см3 метанола и 5 см3 раствора, приготовленного по п. 7.4.4. Патроны готовят непосредственно перед использованием.

7.6 Приготовление растворов внесения

7.6.1. Исходный раствор ацибензолар-C-метила для внесения (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,0100 +/- 0,0001) г ацибензолар-C-метила, добавляют 50 — 70 см3 ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

7.6.2. Раствор № 1 ацибензолар-C-метила для внесения (концентрация 1 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 1 см3 исходного раствора ацибензолар-C-метила (п. 7.6.1) с концентрацией 100 мкг/см3, разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор № 1 хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

7.7 Приготовление градуировочных растворов

7.7.1. Исходный раствор бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты для градуировки (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,0100 +/- 0,0001) г бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты, добавляют 50 — 70 см3 ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

Растворы № 1 — 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

7.7.2. Раствор № 1 бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты для градуировки (концентрация 1 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 1,0 см3 исходного раствора бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты (п. 7.7.1) с концентрацией 100 мкг/см3, доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор № 1 с концентрацией бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты 1 мкг/см3. Раствор № 1 хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение одного месяца.

7.7.3. Рабочие растворы № 2 — 6 бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты для градуировки (концентрации 2 — 50 нг/см3). В 5 мерных колб вместимостью 100 см3 помещают 5, 2, 1, 0,5 и 0,2 см3 градуировочного раствора № 1 с концентрацией бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты 1 мкг/см3 (п. 7.7.2), доводят до метки смесью для разбавления градуировочных растворов (приготовленного по п. 7.4.1), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 6 с концентрацией бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты 50, 20, 10, 5 и 2 нг/см3 соответственно.

Растворы хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 2 недель.

7.8 Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (I) от концентрации бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты в растворе (нг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят 5 мм3 градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб осуществляют в соответствии с ГОСТ 33985-16 «Салат-латук, эндивий кудрявый, эндивий эскариол свежие. Технические условия»; ГОСТ 7178-15 «Дыни свежие. Технические условия»; ГОСТ 55906-13 «Томаты свежие. Технические условия»; «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).

Образцы салата, дыни, томатов хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более 5 дней. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.

9. Выполнение определения

9.1 Экстракция

Образец измельченного салата, дыни или томатов массой 5 г помещают в плоскодонную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 250 см3, добавляют 45 см3 деионизированной воды, затем 5 см3 раствора, приготовленного по п. 7.4.2, закрывают колбу пробкой и интенсивно встряхивают вручную 5 с, затем ставят на аппарат для встряхивания на 10 мин. Далее колбу помещают в сушильный шкаф при 65 — 70 °C на 30 мин, каждые 10 мин перемешивая содержимое. После доведения температуры раствора до комнатной температуры добавляют 100 см3 метанола, закрывают пробку и ставят на 30 мин на аппарат для встряхивания (на этой стадии пробу можно оставить на ночь). Раствор фильтруют через фильтровальную бумагу в мерный цилиндр на 250 см3, промывая трижды по 20 см3 порциями метанола. Доводят раствор до 200 см3 метанолом и перемешивают. Отбирают аликвоту экстракта объемом 20 см3, добавляют 30 см3 раствора, приготовленного по п. 7.4.3, перемешивают.

9.2 Очистка экстракта

Полученный раствор фильтруют с помощью медицинского шприца через концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.5, со скоростью прохождения раствора 1 — 2 см3/мин, пропуская раствор до верхнего края сорбента. После нанесения пробы, патрон дополнительно промывают 10 см3 раствора, подготовленного по п. 7.4.3, и 10 см3 метанола. Патрон освобождают от следов влаги с помощью разрежения, создаваемого водоструйным насосом (15 минут). Бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновую кислоту (метаболит ацибензолар-C-метила) элюируют с патрона двумя порциями по 5 см3 раствора, приготовленного по п. 7.4.5, упаривают досуха, растворяют остаток в 2,15 см3 водного раствора муравьиной кислоты (подготовленного по п. 7.4.1), выдерживают 1 — 2 мин на ультразвуковой ванне, фильтруют через мембранный фильтр, анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.

9.3 Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов.

Источник ионизации: электростатическое распыление.

Режим работы: регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация «перехода»).

Материнский ион (масса/заряд): 181,0.

Дочерние ионы (масса/заряд): 65,1 (количественный расчет), 53,1.

Напряжение на фрагментаторе, В: 124.

Энергия разрушения (соударения), В: 25 (181,0 \rightarrow 65,1) , 37 (181,0 \rightarrow 53,1) .

Скорость сканирования: 200 мс.

Давление на распылителе: 35 psi.

Скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм3/мин.

Температура газа 1: 250 °C.

Скорость газа 2 (азот): 11 дм3/мин.

Температура газа 2: 340 °C.

Температура квадруполей (1 и 3): 100 °C.

Хроматографическая колонка стальная длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм.

Температура колонки: 40 °C.

Скорость потока элюента: 0,3 см3/мин.

Объем вводимой пробы: 5 мм3.

Подвижная фаза: компонент А — 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в воде; компонент Б — метанол. Режим элюирования — изократический (А:Б в соотношении 75:25).

Линейный диапазон детектирования 0,01 — 0,25 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 50 нг/см3, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

10. Обработка результатов анализа

Содержание ацибензолар-C-метила в пробах салата, дыни, томатов (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

X = 1,167 \cdot \frac{A \cdot V \cdot K}{1000 \cdot m} , где

A — концентрация бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, нг/см3;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;

m — масса (объем) анализируемого образца, г (см3);

K — коэффициент, учитывающий объема экстракта, взятого для анализа, K = 10;

1,167 — коэффициент пересчета содержания бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты в содержание ацибензолар-C-метила (конверсивный фактор).

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 \cdot \sigma_{r} .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание ацибензолар-C-метила в пробах воды салата, дыни, томатах — менее 0,01 мг/кг».

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 2 до 50 нг/см3.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

A = \frac{|X - C| \cdot 100}{C} \leq B , где

X — концентрация бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты в пробе при контрольном измерении, нг/см3;

C — известная концентрация градуировочного раствора бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, нг/см3;

B — норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов бензо[1,2,3]тиадиазол-7-карбоновой кислоты, предусмотренных МИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.8.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом «добавок».

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

\text{С}_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime} , где

\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:

\text{К}_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - \text{С}_{\partial} , где

\overline{X}\prime , \overline{X} , Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К} = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}}

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Кк| <= К, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , где (3)

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Методические указания разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, В.В. Баюшева).