МУК 4.1.3479-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовых концентраций N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в крови методом капиллярной газовой хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 15.06.2017)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 15 июня 2017 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ИЗМЕРЕНИЕ МАССОВЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ N-НИТРОЗОАМИНОВ (N-НИТРОЗОДИМЕТИЛАМИН, N-НИТРОЗОДИЭТИЛАМИН) В КРОВИ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3479-17

1. Подготовлены коллективом авторов ФГБНУ «Восточно-Сибирский институт медико-экологических исследований», Федеральным бюджетным учреждением науки ФНЦ «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», ФБУН «Нижегородский НИИ гигиены и профпатологии» Роспотребнадзора, ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 15 июня 2017 г.

4. Введены впервые.

Методические указания разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки ФНЦ «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (Уланова Т.С., Зайцева Н.В., Нурисламова Т.В., Попова Н.А., Мальцева О.А., Терентьев Г.И.).

Введение

Включенные в сборник 9 методических указаний по определению химических соединений в биологических средах, объектах окружающей среды и молочной продукции предназначены для использования в химико-аналитических исследованиях при проведении биомониторинга состояния здоровья населения, для практического использования в рамках социально-гигиенического мониторинга на территориях с высокой антропогенной нагрузкой, а также могут быть использованы для диагностических целей в рамках осуществления государственного санитарного надзора, контроля, экспертизы, расследований. Методические указания предназначены для специалистов химико-аналитических лабораторий системы Роспотребнадзора, научно-исследовательских институтов, работающих в области экологии человека, гигиены окружающей среды и защиты прав потребителей.

Методические указания, включенные в сборник, разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений», ГОСТ Р 1.5-92 «ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов», МИ 2335-95 «Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа», МИ 2336-95 «Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритм оценивания».

Все методики измерения прошли метрологическую аттестацию в соответствии с правилами ПР 50.2.002-94 «ГСИ. Порядок осуществления государственного метрологического надзора за выпуском, состоянием и применением средств измерений, аттестованными методиками выполнения измерений, эталонами и соблюдением метрологических правил и норм».

В методических указаниях, включенных в сборник, приведены методы определения 6 органических соединений в биологических средах (моча, кровь) и молочной продукции, 4 тяжелых металлов в молочной продукции и 20 тяжелых металлов и элементов в атмосферном воздухе. Определение токсичных веществ и элементов основано на использовании современных высокочувствительных методов физико-химического анализа — капиллярной газожидкостной хроматографии, хромато-масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, высокоэффективной жидкостной хроматографии, потенциометрии с применением ионселективного электрода.

Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Свидетельство о метрологической аттестации № 88-16207-005-RA.RU.310657-2015 от 30.06.2015.

1. Назначение и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газовой хроматографии для измерения массовых концентраций N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробах крови в диапазоне концентраций от 0,002 до 0,1 мг/дм3.

1.2. Методические указания по измерению массовых концентраций N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробах крови предназначены для использования в санитарно-гигиенических, экологических, лечебных и научных организациях, осуществляющих деятельность в области профпатологии и экологии человека.

1.3 Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Физико-химические и токсикологические свойства

N-нитрозоамины малоустойчивые вещества, стабильны только при температурах ниже 0 °C, являются жидкими или твердыми веществами желтого цвета.

N-нитрозоамины являются высокотоксичными соединениями и при попадании в организм поражают печень, вызывают кровоизлияния.

Большая часть N-нитрозоаминов обладает сильным канцерогенным действием даже при однократном действии, проявляет мутагенные свойства. N-нитрозодиметиламин обладает отдаленными эффектами: эмбриотропным, гонадотропным, мутагенным.

N-нитрозодиметиламин: CAS 62-75-9, формула C2H6N2O/(CH3)2NN=O, молекулярная масса: 148,0, Tкип: 153 °C. Растворимость в воде хорошая, давление паров, Па, при 20 °C: 360, класс опасности: 1-й.

N-нитрозодиэтиламин: CAS 55-18-5, формула C2H6N2O/(C2H5)2NN=O, молекулярная масса: 176,0, Tкип: 175 °C, растворимость в воде, г/100 см3, при 20 °C: 10,6, класс опасности 1-й.

3. Метрологические характеристики методики выполнения измерений

При соблюдении всех регламентированных условий и проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Таблица 1

Диапазон измерений массовых концентраций N-нитрозоаминов в пробах крови, значения показателей точности, правильности и прецизионности измерений

Значения показателя точности используют:

• при оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;
• при оценке деятельности лабораторий по вопросу качества проведения измерений;
• при оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

4. Метод измерения

Измерение массовых концентраций N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в пробе крови выполняют газохроматографическим методом анализа с термоионным детектированием. Извлечение и концентрирование N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) из проб крови проводят методом дистилляции с водяным паром в щелочной среде, концентрированием N-нитрозоаминов на картриджах с помощью системы твердофазной экстракции (ТФЭ) и последующим газохроматографическим анализом экстракта.

Определению не мешают углеводороды, спирты. Длительность измерений — 30 мин.

5. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

При выполнении измерений и подготовке проб применяют следующие средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы:

5.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

5.3 Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6. Требования безопасности и охраны окружающей среды

6.1. При выполнении работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцию по эксплуатации прибора.

6.4. При работе с сосудами, работающими под давлением необходимо соблюдать правила их устройства и безопасной эксплуатации в соответствии с Федеральными нормами и правилами в области промышленной безопасности «Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением», утверждены Приказом Федеральной службы по экологическому, технологическому и атомному надзору от 25 марта 2014 г. № 116.

6.5. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005-88, ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

6.6. Организуют обучение работающих безопасности труда по ГОСТ ₁₂.0.004-90.

6.7. При работе с биологическими средами соблюдают санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08.

7. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на газовом хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

8. Требования к условиям измерений

При приготовлении градуировочных растворов и подготовке проб к анализу соблюдают следующие условия:

• температура окружающего воздуха: (20 +/- 5) °C;
• атмосферное давление: от 84,0 до 106,7 кПа (630 — 800 мм рт. ст.);
• относительная влажность воздуха: от 30 до 80%;
• напряжение в сети: (220 +/- 10) В;
• частота переменного тока: (50 +/- 10) Гц.

Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерений

При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы: подготовка стеклянной посуды, подготовка хроматографической системы, приготовление растворов, приготовление градуировочных растворов, построение градуировочной характеристики, отбор проб.

9.1 Подготовка посуды

В термостойкий стакан вместимостью 2 дм3 помещают 50 г калия двухромовокислого, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дм3 концентрированной серной кислоты.

Используемую посуду необходимо замочить в свежеприготовленном 3%-м растворе калия двухромовокислого в серной кислоте, промыть проточной водопроводной водой, ополоснуть дистиллированной водой и высушить в сушильном шкафу при температуре 105 °C.

9.2 Подготовка хроматографической системы

Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации хроматографа.

9.2.1 Кондиционирование кварцевой капиллярной колонки

Новую кварцевую капиллярную колонку предварительно кондиционируют в токе газа-носителя (азота) с расходом 4 см3/мин, нагревая в термостате хроматографа ступенчато с 70 до 240 °C в течение 2 часов и выдерживают при 250 °C в течение суток.

После охлаждения до комнатной температуры колонку подключают к детектору и проверяют стабильность нулевой линии при рабочей температуре термостата колонок. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

9.2.2 Условия хроматографирования

Устанавливают режим работы газового хроматографа в соответствии со следующими условиями:

Записывают нулевую линию при установленных режимных параметрах. При отсутствии флуктуации приступают к работе.

9.3 Приготовление растворов

9.3.1. Приготовление исходного раствора. В мерную пробирку объемом 10 см3, дозатором добавляют бидистиллированную воду в объеме 2 см3, микрошприцем вводят по 2 мм3 N-нитрозоаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин). Весовое содержание компонентов в исходном растворе составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества): N-нитрозодиметиламин — 1,005 мг/см3, N-нитрозодиэтиламин — 0,942 мг/см3. Срок хранения раствора 12 часов.

9.3.2. Приготовление рабочего стандартного раствора. В мерную пробирку объемом 2 см3, содержащую бидистиллированную воду в объеме 1,0 см3, вводят дозатором 20 мм3 исходного раствора N-нитрозоаминов.

Массовая концентрация N-нитрозодиметиламина в рабочем растворе для градуировки составляет 0,02 мг/см3, N-нитрозодиэтиламина 0,0188 мг/см3. Срок хранения раствора 5 часов.

9.4 Приготовление градуировочных растворов

9.4.1. Приготовление градуировочных растворов. Градуировочные растворы N-нитрозоаминов готовят в мерных пробирках объемом 5 см3. Для этого в каждую пробирку дозатором вносят по 5 см3 крови и добавляют рабочий раствор для градуировки в соответствии с табл. 2 и тщательно перемешивают.

Таблица 2

Растворы для установления градуировочной характеристики

9.5 Построение градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади хроматографического пика (Гц·с) от массовой концентрации N-нитрозоаминов (мг/дм3) в дистиллированной воде, устанавливают по 5 сериям измерений, по 5 концентрациям каждого вещества в каждой серии для каждого диапазона в соответствии с табл. 2.

К дистиллированной воде объемом 45 см3 добавляют градуировочный раствор N-нитрозоаминов (табл. 3) объемом 5 см3. Пробу помещают в круглодонную колбу объемом 500 см3, добавляют гидрооксид калия (8 г) и с помощью водяного пара, образуемого в парообразователе, N-нитрозоамины отгоняют. Дистиллят, сконденсированный в холодильнике, собирают в объеме 70 см3 в коническую колбу-приемник. Затем дистиллят пропускают через картридж на угольной основе автоматической системы ТФЭ. По истечении 30 мин экстракт хлористого метилена объемом 2 мм3 через испаритель вводят в хроматографическую колонку. Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора. На полученной хроматограмме определяют площади пиков компонентов и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику.

Процедуру градуировки проводят 1 раз в 3 месяца, а также при внедрении методики в практику лаборатории, после ремонта хроматографа, отрицательных результатах контроля стабильности градуировочной характеристики.

9.6 Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация N-нитрозоаминов соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

|Cm — C| <= 0,15·C, где (1)

C — заданная массовая концентрация N-нитрозоаминов в градуировочном растворе, мг/дм3;

Cm — результат измерения массовой концентрации N-нитрозоаминов в образце для градуировки, мг/дм3.

Значения норматива контроля стабильности градуировочной характеристики Кгр приведены в табл. 3.

Таблица 3

Значения нормативов контроля стабильности градуировочной характеристики

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

10. Выполнение измерений

10.1 Отбор проб

Отбор проб крови в объеме не менее 5 см3 производится в вакуумные пробирки с гепарином (из расчета на 5 см3 крови — 0,05 см3 гепарина с концентрацией 5 000 ЕД/см3) для забора крови. Анализ проб крови проводят непосредственно после отбора проб. Допускается хранение проб в морозильной камере не более 5 дней.

10.2 Подготовка проб

К исследуемому образцу крови объемом 5 см3 добавляют дистиллированную воду объемом 45 см3. Пробу помещают в круглодонную колбу объемом 500 см3, добавляют гидрооксид калия (8 г) и с помощью водяного пара, образуемого в парообразователе, N-нитрозоамины отгоняют. Дистиллят, сконденсированный в холодильнике, собирают в объеме 70 см3 в коническую колбу-приемник. Затем дистиллят пропускают через картридж на угольной основе автоматической системы ТФЭ. По истечении 30 мин экстракт хлористого метилена объемом 2 мм3 через испаритель вводят в хроматографическую колонку и анализируют при условиях по п. 9.5.

Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб крови. Условия выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной характеристики (п. 9.5).

11. Обработка (вычисление) результатов измерений

11.1. На хроматограмме рассчитывают площадь пика и по градуировочной характеристике определяют массовую концентрацию N-нитрозоаминов в крови.

11.2. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение \overline{\text{С}} двух результатов измерений (C₁, C₂), полученных в условиях повторяемости (параллельных определений), для которых выполняется условие:

|C_{1} - C_{2}| \leq 0,01 \cdot r \cdot \frac{C_{1} + C_{2}}{2} , где (2)

r — предел повторяемости, %. Значения предела повторяемости приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (2) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

|C_{max,4} - C_{min,4}| \leq 0,01 \cdot CR_{0,95}(4) \cdot \frac{C_{1} + C_{2} + C_{3} + C_{4}}{4} , где (3)

CR0,95(4) — критический диапазон, %. Значения критического диапазона приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (3) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условий (2) и (3).

12. Оформление результатов измерений

Результат измерений представляют в виде (\overline{\text{С}} \pm \Delta_{\text{л}})\text{мг}/\text{дм}^{3} , где

\overline{\text{С}} — результат измерений, полученный в соответствии с процедурами разделов 9 - 11, мг/дм3;

\pm \Delta_{\text{л}} — границы абсолютной лабораторной погрешности измерений массовой концентрации N-нитрозодиметиламина или N-нитрозодиэтиламина, мг/дм3, при P = 0,95.

Значение \Delta_{\text{л}} рассчитывают по формуле:

\Delta_{\text{л}} = \frac{\delta_{\text{л}} \cdot \overline{\text{С}}}{100} , где (4)

значение \delta_{\text{л}} приведено в табл. 1.

13. Процедуры обеспечения достоверности измерений

13.1. Обеспечение достоверности измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях повторяемости, внутрилабораторной прецизионности, оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6.

13.2. Проверка приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности, являются образцы крови с внесенными в них добавками растворов N-нитрозоаминов, подготовленных в соответствии с п. 9.4.1.

Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности (в пределах одной лаборатории, разными операторами, в разное время), проводят по результатам измерений массовых концентраций N-нитрозоаминов в образцах крови с одинаковым содержанием N-нитрозоаминов.

Результаты измерений признают приемлемыми при выполнении условия:

\frac{|C_{1} - C_{2}|}{(C_{1} - C_{2})/2} \cdot 100 \leq R_{\text{л}} , где (5)

C₁ и C₂ - результаты измерений массовых концентраций N-нитрозоаминов, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности, т.е. в одной лаборатории в разное время, разными операторами, мг/дм3;

Rл — предел внутрилабораторной прецизионности, %. Значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 4.

Если условие (5) не выполняется, процедуру повторяют. При повторном превышении предела повторяемости выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

Таблица 4

Диапазон измерений содержания N-нитрозоаминов в пробах крови, значения пределов повторяемости, критического диапазона, внутрилабораторной прецизионности при доверительной вероятности P = 0,95

13.3. Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок.

Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры Кк с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры Кк рассчитывают по формуле:

\text{К}_{\text{к}} = |\overline{C}' - \overline{C} - C_{\text{д}}| , где (6)

\overline{C}' — результат измерений массовой концентрации N-нитрозоамина в пробе с известной добавкой — среднее арифметическое двух результатов измерений полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2), мг/дм3;

\overline{C} — результат измерений массовой концентрации N-нитрозоамина в исходной пробе — среднее арифметическое двух результатов измерений полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2), мг/дм3;

Cд — величина добавки, мг/дм3.

В качестве добавки используют растворы N-нитрозоаминов, приготовленные по п. 9.4.1.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{С}_{\text{с}}\prime_{\text{р}}}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{С}_{\text{ср}}}^{2}} , где (7)

\Delta_{\text{л},\text{С}_{\text{с}}\prime_{\text{р}}} , \Delta_{\text{л},\text{С}_{\text{ср}}} — значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации N-нитрозоаминов в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно, мг/дм3.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: \Delta_{\text{л}} = 0,84 \cdot \Delta с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной, при выполнении условия:

Кк <= К (8)

При невыполнении условия (8) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (8) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.4. Оперативный контроль процедуры измерений, а также реализуемые процедуры контроля стабильности результатов выполняемых измерений, приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

Примечание. При использовании настоящей методики измерений целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории Российской Федерации по соответствующему указателю стандартов, составленному на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный документ заменен (изменен), то при пользовании настоящей методикой измерений, следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.