МУК 4.1.3415-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств спинозинов А и Д в плодах томатов, томатном соке, в луке-перо и луке-репке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 14.02.2017)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 14 февраля 2017 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ СПИНОЗИНОВ А И Д В ПЛОДАХ ТОМАТОВ, ТОМАТНОМ СОКЕ, В ЛУКЕ-ПЕРО И ЛУКЕ-РЕПКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3415-17
1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, Н.В. Устименко, Е.Н. Тестова).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 14 февраля 2017 г.
Свидетельство о метрологической аттестации МВИ от 31.03.2016 № РОСС RU.0001.310430/0257.31.03.2016.
Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств спинозинов А и Д в плодах томатов и томатном соке, в луке-перо и луке-репке в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг (каждого) и 0,1 — 1,0 мг/кг (по сумме спинозинов А и Д).
Методические указания носят рекомендательный характер.
Спиносад — смесь (2R,3aR,5aR,5bS,9S,13S,14R,16aS,16bR)-2-(6-дезокси-
2,3,4-три-O-метил- \alpha -L-манно-пиранозилокси)-13-(4-диметиламино-
2,3,4,6-тетрадезокси- \beta -Д-эритропиранозилокси)-9-этил-2,3,3a,5a,5b,
6,7,9,10,11,12,13,14,15,16a,16b-гексадекогидро-14-метил-1H-8-оксациклододека-
[b]as-индацен-7,15-диона и (2S,3aR,5aS,5bS,9S,13S,14R,16aS,16bS)-
2-(6-дезокси-2,3,4-три-O- \text{метил}\alpha -L-маннопиранозилокси)-13-(4-диметиламино-
2,3,4,6-тетрадезокси- \beta -Д-эритропиранозилокси)-9-этил-2,3,3a,5a,
5b,6,7,9,10,11,12,13,14,15,16a,16b-гексадекогидро-4,14-диметил-1H-8-оксациклододека
[b]as-индацен-7,15-диона в соотношении от 5:95% до 50:50%.
Молекулярная масса: спинозин А — 732,0; спинозин Д — 746,0.
Эмпирическая формула: спинозин А — C41H65NO10; спинозин Д — C42H67NO10.
Агрегатное состояние: порошок.
Цвет, запах: светло-серый или белый.
Давление паров (при 25 °C): 3,0 x 10-5 МПа — для спинозина А; 2,0 x 10-5 МПа — для спинозина Д.
Коэффициент распределения в системе октанол-вода:
- спинозин А — Kow log P 2,8 (pH 5), 4,0 (pH 7), 5,2 (pH 9);
- спинозин Д — Kow log P 3,2 (pH 5), 4,5 (pH 7), 5,2 (pH 9).
Температура плавления: спинозин А — 84,0 — 99,5 °C; спинозин Д — 161,5 — 170,0 °C.
- спинозин А — 89 мг/дм3 (дистиллированная вода), 235 мг/дм3 (20 °C и при pH 7);
- спинозин Д — 0,5 мг/дм3 (дистиллированная вода), 0,33 мг/дм3 (20 °C и при pH 7).
Растворимость в органических растворителях (г/л при 20 °C):
- спинозин А: ацетон — 16,8; ацетонитрил — 13,4; хлористый метилен — 52,5; метанол — 19,0; гексан — 0,448; толуол — 45,7; н-октанол — 0,926;
- спинозин Д: ацетон — 1,01; ацетонитрил — 0,255; хлористый метилен — 44,8; метанол — 0,252; гексан — 0,743; толуол — 15,2; н-октанол — 0,127.
Оба вещества устойчивы к гидролизу при pH 5 и pH 7; ДТ50 при pH 9 составляет 200 дней для спинозина А и 259 дней для спинозина Д. Фотодеградация в воде: ДТ50 при pH 7 составляет 0,93 дня для спинозина А и 0,82 дня для спинозина Д.
Краткая токсикологическая характеристика. Спиносад относится к веществам малоопасным по острой оральной (ЛД50 для самок крыс 3 783 мг/кг, для самцов крыс — более 5 000 мг/кг) и дермальной (ЛД50 для кроликов более 2 000 мг/кг) токсичности, но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК50 для крыс (4 ч) более 5 180 мг/м3). Он не вызывает раздражения кожи, отмечается лишь слабое покраснение глаз у кроликов. Не обладает мутагенным и нейротоксичным свойствами или репродуктивной токсичностью.
Область применения. Спиносад — инсектицид контактного и кишечного действия из группы спинозинов, обладающий парализующим эффектом.
Он эффективно подавляет развитие вредителей из отрядов жесткокрылых, бахромчатокрылых, прямокрылых, двукрылых и чешуекрылых (имаго и личинки) в посевах зерновых, плодовых, овощных и декоративных культур при норме расхода 5 — 40 г д.в./га. Препараты на основе спиносада используются также для борьбы с синантропными насекомыми и в ветеринарии.
В России установлены следующие гигиенические нормативы:
ВДСД — 0,02 мг/кг массы человека;
ПДК в воде водоемов — 0,11 мг/дм3;
ОБУВ в воздухе рабочей зоны — 1,0 мг/м3;
ОБУВ в атмосферном воздухе — 0,002 мг/м3;
МДУ в продукции (мг/кг): огурцы — 1,0; перец — 2,0; картофель — 0,5;
МДУ в импортируемой продукции (мг/кг): лук — 0,2;
В МДУ в импортируемой продукции (мг/кг): томаты — 0,3; лук — 0,2.
1. Погрешность измерений
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические параметры для спинозина А и спинозина Д
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для спинозина А и спинозина Д
2. Метод измерений
Метод основан на определении спинозинов А и Д с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта на концентрирующих патронах № 1, 2 и 3.
Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1 Средства измерений
| Весы аналитические класса точности — специальный (I) с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г | ГОСТ Р 53228-08 |
|---|---|
| Весы лабораторные общего назначения класса точности — средний (III) с наибольшим пределом взвешивания до 400 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,5 г | ГОСТ Р 53228-08 |
| Колбы мерные на 10, 25, 50, 100, 500 и 1 000 см3 | ГОСТ 1770-74 |
| Микрошприц объемом 100 мм3 со шкалой деления 0,001 см3 и погрешностью менее 1% от номинального объема | |
| Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 см3 | ГОСТ 29227-91 |
| Хроматографическая система, включающая: - хроматограф жидкостный, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °C, с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу; - компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ |
|
| Цилиндры мерные на 10, 25, 50, 100 и 500 см3 | ГОСТ 1770-74 |
Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
| Спинозин А, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 93,1% | CAS 131929-60-7 |
|---|---|
| Спинозин Д, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 94,0% | CAS 131929-63-0 |
| Аммоний уксуснокислый, ч | ГОСТ 3117-78 |
| Ацетон, осч | ТУ 6-09-3513-86 |
| Ацетонитрил, осч, УФ-200 нм | ТУ 6-09-2167-84 |
| Вода дистиллированная и (или) бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости) |
ГОСТ 6709-72 |
| Гелий, очищенный | ТУ-51-940-80 |
| n-Гексан, хч | ТУ 6-09-3818-89 |
| Калий марганцовокислый, чда | ГОСТ 20490-75 |
| Кальций хлористый, ч | ТУ 6-09-4711-81 |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции со слабоосновным сорбентом с размером частиц 63 — 200 мкм, с привитыми аминогруппами (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) (патрон № 1) | ТУ 4215-002-05451931-94 |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции с гидрофильным слабокислым сорбентом с постоянной активностью, с размером частиц 63 — 200 мкм (C) (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) (патрон № 2) | ТУ 4215-002-05451931-94 |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции с сильноосновным анионообменником с привитыми четвертичными аммониевыми группами (TA) с размером частиц 63 — 200 мкм (C) (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) (патрон № 3) | ТУ 4215-002-05451931-94 |
| Натрий сернокислый, безводный, хч | ГОСТ 4166-76 |
| Натрий хлористый, хч | ГОСТ 4233-77 |
| Спирт метиловый (метанол), хч | ГОСТ 6995-77 |
Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
| Алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами | ГОСТ 25336-82 |
|---|---|
| Аппарат для встряхивания проб с возвратно-поступательным направлением колебаний, с максимальной загрузкой 10 кг, с амплитудой колебаний 30 мм и скоростью от 10 до 300 колебаний в минуту | |
| Банки полипропиленовые с крышками для экстракции вместимостью 250 см3 | |
| Ванна ультразвуковая с потребляемой мощностью 140 Вт, рабочей частотой 50 Гц, рабочим объемом 4,5 дм3 | |
| Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная | ГОСТ 5556-81 |
| Воронки делительные на 250 см3 | ГОСТ 25336-82 |
| Воронки лабораторные, стеклянные | ГОСТ 25336-82 |
| Испаритель ротационный вакуумный с ручным подъемником, с диагональным конденсором и объемом испарительной колбы от 50 до 3 000 см3, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об./мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом 5 дм3 и с диапазоном температур от 20 до 100 °C | |
| Колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1 000 см3 | ГОСТ 25336-82 |
| Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100, 250 см3 и 4 000 см3 ТС | ТУ 92-891.029-91 |
| Колонка хроматографическая стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18 | |
| Насос диафрагменный, химически стойкий на 100% с мощностью электропривода 245 Вт, предельным вакуумом 100 мбар/абс, с избыточным давлением 1 бар и скоростью откачки 34 дм3/мин | |
| Предколонка хроматографическая стальная длиной 20,0 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C8 | |
| Миксер ручной погружной мощностью 260 Вт и с максимальной скоростью вращения от 2 000 до 12 500 об./мин | |
| Стаканы стеклянные, термостойкие объемом 100 — 500 см3 | ГОСТ 25336-82 |
| Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4 000 см3 и приемной конической колбой объемом 1 000 см3 | |
| Фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие диаметром 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г | ТУ-6-09-1678-86 |
| Шприц инъекционный многократного применения объемом 10 см3 | ГОСТ 22967-90 |
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТу 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТу 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТу 12.1.004-91.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению определений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов № 1, 2 и 3 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах № 1, 2 и 3, установление градуировочной характеристики.
7.1 Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.
7.1.2 Очистка ацетона
Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см3 аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/дм3. Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C отбрасывают.
7.1.3 Приготовление бидистиллированной воды
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см3 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3 и кипятят в течение 6 часов.
Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.
7.1.4 Очистка гексана
Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Гексан перегоняют при температуре 68,7 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 68,7 °C, отбрасывают.
7.2 Приготовление растворов для проведения анализа
7.2.1 Приготовление 2%-го водного раствора уксуснокислого
аммония
В мерную колбу объемом 1 000 см3 переносят 20 г аммония уксуснокислого, добавляют 500 см3 бидистиллированной воды и перемешивают до полного растворения соли. Доводят водой объем в колбе до метки и еще раз тщательно перемешивают. Раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.2 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ
В плоскодонную колбу объемом 1 дм3 помещают 350 см3 ацетонитрила, 350 см3 метанола и 200 см3 2%-го водного раствора уксуснокислого аммония. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см3/мин в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.
7.2.3 Приготовление смеси для растворения проб
и приготовления стандартных растворов
В колбу объемом 100 см3 помещают 50 см3 ацетонитрила, прибавляют 50 см3 метанола и тщательно перемешивают. Смесь используют для растворения проб и приготовления стандартных растворов.
7.2.4 Приготовление градуировочных растворов
Спинозин А и спинозин Д разлагаются под воздействием света. При работе как со стандартными растворами, так и с аналитическими пробами следует соблюдать меры предосторожности: защищать от света (например, обертывать черной бумагой) колбы с экстрактами, концентрирующие патроны № 1, 2 и 3, концентраторы с сухим остатком экстракта. Процедуры очистки экстрактов в делительных воронках и упаривания экстрактов на ротационном вакуумном испарителе необходимо проводить в затемненной комнате (без включения электрического света).
7.2.4.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией спинозина А 100,0 мкг/см3. Взвешивают 10 мг спинозина А в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в смеси для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3) и доводят объем до метки этой же смесью. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления смесевых стандартных растворов спинозинов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 1 хранят в холодильнике не более 2 месяцев.
7.2.4.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией спинозина Д 100,0 мкг/см3. Взвешивают 10 мг спинозина Д в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в смеси для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3) и доводят объем до метки этой же смесью. Полученный стандартный раствор № 2 используется для приготовления смесевых стандартных растворов спинозинов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 2 хранят в холодильнике не более 2 месяцев.
7.2.4.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 10,0 мкг/см3 каждого. Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 10 см3, помещают в мерную колбу объемом 100 см3. Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 10 см3 и помещают в ту же колбу объемом 100 см3, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 3 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 3 хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.4.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 5,0 мкг/см3 каждого. Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 4 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 4 хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.4.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 2,5 мкг/см3 каждого. Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 5 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 5 хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.4.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 1,0 мкг/см3 каждого. Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 6 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 6 хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.4.7. Стандартный раствор № 7 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 0,5 мкг/см3 каждого. Из стандартного раствора № 6 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 7 используется для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 7 хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.4.8. Стандартный раствор № 8 с концентрацией спинозина А и спинозина Д по 0,25 мкг/см3 каждого. Из стандартного раствора № 5 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3, доводят объем до метки смесью для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3). Стандартный раствор № 8 используется для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 8 хранят в холодильнике не более 1 месяца.
7.2.4.9. Стандартные растворы спинозина А и спинозина Д с концентрациями 10,0; 5,0; 2,0 и 1,0 мкг/см3 для хроматографического исследования и для внесения в контрольные образцы. Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 10,0; 5,0; 2,0 и 1,0 мкг/см3 и используют эти растворы для хроматографического исследования и для внесения в контрольные образцы.
7.3 Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации спинозина А и спинозина Д в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 2,5; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/см3.
В инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
7.4 Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки
экстрактов и проверка хроматографического поведения спинозинов А и Д на них
7.4.1 Подготовка концентрирующих патронов № 1
для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: патрон последовательно промывают 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и 10 см3 гексана. Элюаты отбрасывают. Нельзя допускать высыхания патрона.
7.4.2 Проверка хроматографического поведения спинозинов
А и Д на концентрирующих патронах № 1
Для проверки хроматографического поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 1 готовят контрольный экстракт анализируемой матрицы (плоды томата, томатный сок, лук-перо и лук-репка) по соответствующей методике и проводят все процедуры очистки, предшествующие очистке на патронах.
Из стандартного раствора спинозина А и спинозина Д в ацетонитриле, содержащего по 10 мкг/см3 каждого соединения, отбирают 1 см3, помещают в концентратор объемом 100 см3 с контрольной пробой матрицы и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетона, помещают на 30 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор прибавляют 9 см3 гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см3 смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Исходный концентратор обмывают сначала 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, а затем двумя порциями по 5 см3 каждая смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и последовательно вносят растворы на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см3 и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см3 смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие спинозин А и спинозин Д, полноту смывания и необходимый объем элюента.
Изучение поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
7.5 Подготовка концентрирующих патронов № 2 для очистки
экстрактов и проверка хроматографического поведения спинозинов А и Д на них
7.5.1 Подготовка концентрирующих патронов № 2
для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 2 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1. Элюат отбрасывают.
7.5.2 Проверка хроматографического поведения спинозинов
А и Д на концентрирующих патронах № 2
Для проверки хроматографического поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 1 готовят контрольный экстракт анализируемой матрицы (плоды томата, томатный сок, лук-перо и лук-репка) по соответствующей методике и проводят все процедуры очистки, предшествующие очистке на патронах.
Из стандартного раствора спинозина А и спинозина Д в ацетонитриле, содержащего по 10 мкг/см3 каждого соединения, отбирают 1 см3, помещают в концентратор объемом 100 см3 с контрольной пробой матрицы и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 см3 смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Исходный концентратор обмывают сначала 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:2, а затем двумя порциями по 10 см3 ацетона и двумя порциями по 10 см3 смеси ацетонитрила с метанолом в соотношении 1:1 и вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 см3 смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие спинозин А и спинозин Д, полноту смывания и необходимый объем элюента.
Изучение поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 2 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
7.6 Подготовка концентрирующих патронов № 3 для очистки
экстрактов и проверка хроматографического поведения спинозинов А и Д на них
7.6.1 Подготовка концентрирующих патронов № 3 для очистки
экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 3 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: патрон промывают последовательно 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и 10 см3 гексана. Элюаты отбрасывают. Нельзя допускать высыхания патрона.
7.6.2 Проверка хроматографического поведения спинозинов
А и Д на концентрирующих патронах № 3
Для проверки хроматографического поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 1 готовят контрольный экстракт анализируемой матрицы (плоды томата, томатный сок, лук-перо и лук-репка) по соответствующей методике и проводят все процедуры очистки, предшествующие очистке на патронах.
Из стандартного раствора спинозина А и спинозина Д в ацетонитриле, содержащего по 10 мкг/см3 каждого соединения, отбирают 1 см3, помещают в концентратор объемом 100 см3 с контрольной пробой матрицы и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 см3 ацетона, помещают на 30 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор прибавляют 8 см3 гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см3 смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Исходный концентратор обмывают сначала двумя порциями по 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и последовательно вносят растворы на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см3 и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 см3 смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие спинозин А и спинозин Д, полноту смывания и необходимый объем элюента.
Изучение поведения спинозинов А и Д на концентрирующих патронах № 3 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
7.7 Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной
хроматографии
Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 1 см3/мин 3 — 4 часа.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб проводится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», № 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51783-01 «Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. ТУ», ГОСТ Р 55906-13 «Томаты свежие, реализуемые в розничной торговой сети», ГОСТ Р 32876-14 «Консервы. Соки овощные, Сок томатный, ТУ».
Пробы лука и плодов томатов хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 — 4 °C в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранятся в морозильной камере при температуре -18 °C.
Пробы томатного сока хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более 5 суток.
9. Выполнение определения
9.1 Плоды томатов
9.1.1 Экстракция и очистка полученного экстракта
перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Образец измельченных плодов томатов массой 20 г помещают в стеклянный стакан объемом 500 см3, прибавляют 100 см3 ацетонитрила и перемешивают 1 минуту с помощью погружного миксера. Экстракт фильтруют через фильтр низкой плотности в защищенную от света коническую колбу объемом 250 см3 с 5 г хлорида натрия, остаток на фильтре промывают 10 см3 ацетонитрила, перемешивают и выдерживают 5 минут. Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 см3 (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт в делительной воронке промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см3, каждый раз интенсивно встряхивая воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой и верхний гексановый слой. Ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 см3 через слой безводного сульфата натрия, осушитель в колбе промывают 10 см3 ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C.
9.1.2 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1
Сухой остаток, полученный по п. 9.1.1, растворяют в 1 см3 ацетона, тщательно обмывают стенки концентратора, прибавляют в концентратор 9 см3 гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см3. Исходный концентратор обмывают 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и также вносят на патрон, элюаты объединяют в концентраторе объемом 100 см3 и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C.
Сухой остаток растворяют в 4 см3 смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
9.2 Томатный сок
9.2.1 Экстракция и очистка полученного экстракта
перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Образец томатного сока массой 20 г помещают в стеклянный стакан объемом 500 см3, прибавляют 100 см3 ацетонитрила и перемешивают 1 минуту с помощью погружного миксера. Экстракт фильтруют через фильтр низкой плотности в защищенную от света коническую колбу объемом 250 см3 с 5 г хлорида натрия, остаток на фильтре промывают 10 см3 ацетонитрила, перемешивают и выдерживают 5 минут. Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 см3 (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт в делительной воронке промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см3, каждый раз интенсивно встряхивая воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой и верхний гексановый слой. Ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 см3 через слой безводного сульфата натрия, осушитель в колбе промывают 10 см3 ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C.
Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2 «Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1».
После очистки элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 4 см3 смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
9.3 Лук-репка
9.3.1 Экстракция и очистка полученного экстракта
перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Образец измельченного лука-репки массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, защищенную от света, прибавляют 50 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 8:2 и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 8:2 и помещая на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют через фильтр низкой плотности в защищенную от света коническую колбу объемом 250 см3 с 5 г хлорида натрия, перемешивают и выдерживают на 5 минут. Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 см3 (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт в делительной воронке промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см3, каждый раз интенсивно встряхивая воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой и верхний гексановый слой. Ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 см3 через слой безводного сульфата натрия, осушитель в колбе промывают 10 см3 ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C.
9.3.2 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2
Сухой остаток, полученный по п. 9.3.1, растворяют в 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и вносят на подготовленный патрон, элюат отбрасывают. Исходный концентратор сначала обмывают 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:2, а затем 10 см3 ацетона вносят на патрон, элюаты также отбрасывают. Спинозины А и Д элюируют с патрона 10 см3 ацетона и 10 см3 смеси ацетонитрила с метанолом в соотношении 1:1, элюаты объединяют в концентраторе объемом 100 см3 и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C.
Сухой остаток растворяют в 4 см3 смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
9.4 Лук-перо
9.4.1 Экстракция и очистка полученного экстракта
перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Образец измельченного лука-пера массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, защищенную от света, прибавляют 50 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 8:2 и проводят экстракцию и очистку полученного экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.3.1.
9.4.2 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 3
Сухой остаток, полученный по п. 9.4.1, растворяют в 2 см3 ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 см3 гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон № 3. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см3. Исходный концентратор обмывают 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и также вносят на патрон, элюаты объединяют в концентраторе объемом 100 см3 и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C.
Сухой остаток растворяют в 4 см3 смеси для растворения проб (п. 7.2.3) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
9.5 Условия хроматографирования
Хроматографическая система, включающая:
- хроматограф жидкостный, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °C, с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу;
- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.
Колонка хроматографическая стальная длиной 150 мм, с внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.
Предколонка хроматографическая стальная, длиной 20,0 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C8.
Подвижная фаза: ацетонитрил — метанол — 2%-й водный раствор уксуснокислого аммония в соотношении 350:350:200.
Скорость потока элюента: 1,0 см3/мин.
Чувствительность не менее 0,005 AUFS (единиц абсорбции на шкалу).
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартные растворы спинозина А или спинозина Д с концентрацией 2,5 мкг/см3, соответственно разбавляют.
10. Обработка результатов
Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание спинозина А и спинозина Д в пробах рассчитывают по формуле без учета полноты извлечения вещества из проб:
X = \frac{S_{\text{пр}} \cdot A \cdot V}{100 \cdot S_{\text{ст}} \cdot m} \cdot P , где
X — содержание спинозина А или спинозина Д в пробе, мг/кг;
Sст — высота (площадь) пика стандарта, мм;
Sпр — высота (площадь) пика образца, мм;
A — концентрация стандартного раствора, мкг/см3;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г (см3);
P — содержание спинозина А или спинозина Д в аналитическом стандарте, %.
Для определения содержания спиносада в пробах суммируют содержание спинозина А и спинозина Д.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq r , где (1)
X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 \times \sigma_{r} .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг при вероятности P = 0,95, где
\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} , где
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг» <*>.
<*> 0,05 мг/кг — предел обнаружения.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
Контроль стабильности градуировочной характеристики для спинозинов А и Д проводят при смене основных градуировочных растворов № 1 и 2 каждые 2 месяца, при смене основных градуировочных растворов № 3, 4, 5, 6, 7 и 8 — каждый месяц, а также в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание спинозинов А и Д в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,25 до 2,5 мкг/см3.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
A = \frac{(X - C) \cdot 100}{C} \leq 2,75 для спинозина А и 2,81 для спинозина Д, где
X — концентрация спинозинов А и Д контрольного измерения, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора спинозинов А и Д в смеси для приготовления стандартных растворов (п. 7.2.3), взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
2,75 или 2,81 — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 2,75 или 2,81%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов спинозинов А и Д, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:
\text{С}_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X'} , где
\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X'}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} , где
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
\text{К}_{\text{к}} = \overline{X}' - \overline{X} - C_{\text{д}} , где
\overline{X}' , \overline{X} , Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X'}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}}
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq R , где (3)
X1, X2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ СПИНОЗИНА А И СПИНОЗИНА Д ИЗ ПЛОДОВ ТОМАТОВ, ТОМАТНОГО СОКА, ЛУКА-ПЕРА И ЛУКА-РЕПКИ (5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, P = 0,95)