МУК 4.1.3322-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фенпироксимата в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 28.12.2015)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 28 декабря 2015 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЕНПИРОКСИМАТА В БОТВЕ И КОРНЕПЛОДАХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3322-15
1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» (В.И. Долженко, А.С. Комарова, В.В. Человечкова) и ООО «Инновационный центр защиты растений» (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, А.А. Далинова).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 17 декабря 2015 г. № 2).
3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 декабря 2015 г.
Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.197/01.00043/2015 от 08.06.2015.
Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств фенпироксимата в диапазонах: в корнеплодах 0,05 — 0,5 мг/кг, в ботве 0,1 — 1,0 мг/кг.
Методические указания носят рекомендательный характер.
трет-Бутил(E)- \text{ά} -(1,3-диметил-5-феноксипиразол-4-ил-метиленеаминоокси)-р-толуат (ИЮПАК).
Эмпирическая формула: C24H27N3O4.
Химически чистое вещество представляет собой белый кристаллический порошок.
Температура плавления: 99,0 — 102 °C.
Давление пара при 25 °C: 0,0074 МПа.
Растворимость: в воде 0,02 мг/л (при 20 °C), в хлороформе 1179, дихлорметане 1 307, метаноле 15, ацетоне 150 (г/л, при 25 °C).
Стабильность: стабилен в кислых и щелочных средах.
Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD50 для крыс 245 — 480 мг/кг, острая дермальная токсичность LD50 для крыс превышает 2 000 мг/кг. Не ирритант. Ингаляционная токсичность LC50 (4 часа) для крыс 0,33 — 0,36 мг/л воздуха. Класс опасности по ВОЗ II. Не токсичен для пчел.
Область применения препарата: активен в отношении многих видов фитофаговых клещей на плодовых и цитрусовых культурах, обладает ларвицидной, нимфацидной и имагоцидной активностью. Не фитотоксичен.
Гигиенические нормативы для фенпироксимата в России: МДУ — соя (бобы, масло), виноград, плодовые семечковые — 0,3 мг/кг.
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности <*> (границы относительной погрешности) (P = 0,95), \pm \delta , % | Показатель повторяемости (среднеквадратическое отклонение повторяемости), \sigma_{r} , % | Показатель воспроизводимости (среднеквадратическое отклонение воспроизводимости) \sigma_{R} , % | Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, % | Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), R, % (P = 0,95) |
| Ботва свеклы | 0,1 — 1,0 | 22 | 7 | 11 | 20 | 31 |
| Корнеплоды свеклы | 0,05 — 0,5 | 22 | 7 | 11 | 20 | 31 |
| <*> Соответствует расширенной неопределенности Uотн. при коэффициенте охвата k = 2. | ||||||
Полнота извлечения фенпироксимата, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата
Метод основан на определении фенпироксимата методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов ботвы и корнеплодов свеклы ацетонитрилом.
Идентификация фенпироксимата проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1 Средства измерений
3.2 Реактивы
| Ацетонитрил для ВЭЖХ | ТУ 2634-002-04715285-12 |
|---|---|
| Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная) | ГОСТ Р 52501-05 |
| Фенпироксимат с содержанием основного вещества 99,4% | |
| Кислота ортофосфорная, хч | ГОСТ 6552-80 |
| Магний сернокислый, безводный, хч | ГОСТ 4523-67 |
| Натрий хлористый, чда | ГОСТ 4233-77 |
| Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 90:10 |
Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
| Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми бифункциональными полярными группами C18, (250 x 4,6) мм, 5 мкм | |
|---|---|
| Вакуумный манипулятор для работы с патронами для твердофазной экстракции | |
| Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 25, 100 см3 | ГОСТ 9737-93 |
| Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 см3 | |
| Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, с пределом вакуума до 10 мбар | |
| Устройство перемешивающее (50 — 200 колебаний в минуту) | ТУ 4389-007-44330709-11 |
| Центрифуга со скоростью вращения 4 000 об./мин |
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.
Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.
5. Требования к квалификации операторов
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
\cdot процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
\cdot выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7.1 Кондиционирование колонки
Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (1,0 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.
7.2 Приготовление растворов
7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.
7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 90:10 по объему, используя мерные цилиндры. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.
7.3 Приготовление основного и градуировочных растворов
7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,1 мг/см3: точную навеску фенпироксимата (10 +/- 0,1) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.
Градуировочные растворы с концентрациями фенпироксимата 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 90:10).
7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией 2,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 2,0 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.
7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 7 дней, градуировочные растворы использовать в день приготовления.
При изучении полноты определения фенпироксимата используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.
7.4 Построение градуировочного графика
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация фенпироксимата в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации фенпироксимата в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:
где S — площадь пика градуировочного раствора.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
\frac{|C - C_{\text{к}}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.},
где C — аттестованное значение массовой концентрации фенпироксимата в градуировочном растворе,
Cк — результат контрольного измерения массовой концентрации фенпироксимата в градуировочном растворе,
\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 1722-85 «Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая». Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят в закрытой полиэтиленовой таре.
9.1 Экстракция фенпироксимата из ботвы и корнеплодов свеклы
Навеску измельченных ботвы (5 г) или корнеплодов (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, добавляют 20 см3 ацетонитрила, 4 г безводного сульфата магния и 1 г хлорида натрия, пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют (скорость вращения центрифуги — 4 000 об./мин). Берут аликвоту 5 мл и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 20 мм3 вводят в хроматограф.
9.2 Условия хроматографирования
Высокоэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми бифункциональными полярными группами C18, (250 x 4,6) мм, 5 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 90:10. Скорость потока элюента: 1,0 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 260 нм. Объем вводимой пробы 20 мм3. Время удерживания фенпироксимата (6,3 +/- 0,1) мин.
10. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание фенпироксимата в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
X = \frac{S_{x} \cdot K \cdot V}{P} , (1)
где Sх — площадь пика фенпироксимата на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);
K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;
V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;
P — навеска анализируемого образца, 1,25 г для ботвы и 2,5 г для корнеплодов.
Содержание остаточных количеств фенпироксимата в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор фенпироксимата с концентрацией 5,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r, (1)
где X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta \cdot \text{Х}}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае, если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,05 мг/кг*, где *0,05 мг/кг — предел обнаружения фенпироксимата в корнеплодах свеклы).
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:
\text{С}_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},\text{Х}} + \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime},
где \pm \Delta_{\text{л},\text{Х}} \pm (\Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,
где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\Delta = \frac{\delta \cdot \text{Х}}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
где X', X, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}} . (2)
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R, (4)
где X1, X2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.