МУК 4.1.3291-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств касугамицина в воде, почве, зеленой массе, соломе и зерне риса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 28.07.2015)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 28 июля 2015 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КАСУГАМИЦИНА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, СОЛОМЕ И ЗЕРНЕ РИСА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3291-15

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийского НИИ защиты растений» (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, А.С. Комарова, В.В. Человечкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. № 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 июля 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.194/01.00043/2015

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств касугамицина в диапазоне концентраций в воде 0,001 — 0,01 мг/дм3, в почве — 0,05 — 0,5 мг/кг, в зеленой массе и соломе — 1,0 — 10,0 мг/кг, в зерне риса 0,1 — 1,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Касугамицин.

[5-амино-2-метил-6-(2,3,4,5,6-пентагидроксициклогексилокси)тетрагидропиран-3-ил]амино- \alpha -иминоуксусная кислота (IUPAC).

C₁₄H₂₅N₃O₉.

Молекулярная масса 379,4.

Химически чистое вещество представляет собой бесцветное кристаллическое вещество.

Температура плавления: 202 — 204 °C.

Давление пара при 25 °C: < 1,3 x 10-2 мПа.

Растворимость (в г/дм3 при 25 °C): вода — 228; метанол — 0,003; в ацетоне и ксилоле < 0,001.

Стабилен при комнатной температуре. Стабилен в слабых кислотах и нестабилен в сильных кислотах и щелочах. DT50 (50 °C) 47 дней (pH 5), 14 дней (pH 9).

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс более 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для кроликов превышает 2 000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и тератогенными свойствами, не влияет на репродукцию крыс.

Область применения препарата

Системный фунгицид и бактерицид, получаемый ферментацией Streptomyces kasugaensis. Используется для контроля грибных и бактериальных заболеваний на рисе, овощных и плодовых культурах.

Не фитотоксичен для риса, томатов, сахарной свеклы, картофеля и др.

В России для касугамицина гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Методика основана на определении касугамицина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов подкисленным метанолом, для почвы — раствором щелочи и последующей очистки на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация касугамицина проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Подготовка патронов для очистки экстрактов

Патрон № 1 или № 2 для твердофазной экстракции промывают последовательно 3 см3 метанола и 3 см3 воды, после чего они готовы к работе.

7.3. Приготовление растворов

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления 0,005 М гидроксида натрия в мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 0,2 г натрия гидроокиси и доводят объем бидистиллированной водой до метки.

7.3.3. Для приготовления 0,01%-го раствора соляной кислоты в метаноле в мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 0,1 см3 концентрированной соляной кислоты и доводят объем метанолом до метки.

7.3.4. Для приготовления 0,001%-го раствора соляной кислоты в метаноле в мерную колбу объемом 100 см3 помещают 10 см3 0,01%-го раствора соляной кислоты в метаноле и доводят объем метанолом до метки.

7.3.5. Для приготовления 1 № соляной кислоты в мерную колбу объемом 10 см3 помещают 1,7 см3 концентрированной соляной кислоты и доводят объем водой до метки.

7.4. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 1,0 мг/см3: точную навеску касугамицина (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, растворяют в метаноле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями касугамицина 0,2; 0,4; 0,8; 1,5; 2,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя в виде растворителя подвижную фазу.

7.4.2. Раствор № 1 с концентрацией 2,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.3. Раствор № 2 с концентрацией 1,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,15 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,8 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 4 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,4 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.

При изучении полноты определения касугамицина в воде, почве, зеленой массе, соломе и зерне риса используют растворы вещества в подвижной фазе, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему растворителем.

7.5. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация касугамицина в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации касугамицина в градуировочном растворе. Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

C = K·S,

где S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|C - C_{K}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}},

где C — аттестованное значение массовой концентрации касугамицина в градуировочном растворе,

CK — результат контрольного измерения массовой концентрации касугамицина в градуировочном растворе,

\lambda_{\text{контр}} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}} = 10\% при P = 0,95).

7.6. Проверка хроматографического поведения касугамицина на патроне № 1

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора касугамицина с концентрацией 10 мкг/см3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см3 воды и переносят на подготовленный патрон № 1 (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см3 воды и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 10 см3 воды. Элюаты от нанесения и промывки собирают фракциями по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют по п. 9.6.

Фракции, содержащие касугамицин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

7.7. Проверка хроматографического поведения касугамицина на патроне № 2

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора касугамицина с концентрацией 10 мкг/см3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 5 см3 воды и переносят на подготовленный патрон № 2 (п. 7.2). Промывают патрон 5 см3 воды, элюат отбрасывают. Затем элюируют касугамицин 6 см3 1 № соляной кислоты со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют по п. 9.6.

Фракции, содержащие касугамицин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения касугамицина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 31861-12 «Вода. Общие требования к отбору проб»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб»; ГОСТ 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб» и ГОСТ 6293-90 «Рис. Требования при заготовке и поставке». Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают.

Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

9. Проведение определения

9.1. Определение касугамицина в воде

Пробу воды (200 см3) количественно переносят на подготовленный патрон № 1 (п. 7.2). Промывают патрон 5 см3 воды. Элюат собирают в круглодонную колбу емкостью 250 см3 и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют на содержание касугамицина по п. 9.6.

9.2. Определение касугамицина в почве

10 г почвы помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 и добавляют 30 см3 0,005 М раствора натрия гидроксида. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, центрифугируют при скорости 4 000 об./мин в течение 10 мин. Аликвоту экстракта — 12 см3 далее очищают по п. 9.4.

9.3. Определение касугамицина в зеленой массе, соломе и зерне риса

Навеску измельченной пробы (10 г — зерно; 2 г — зеленая масса, солома) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 и добавляют 40 см3 0,01% соляной кислоты в метаноле. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, центрифугируют при скорости 4 000 об./мин в течение 10 мин. Аликвоту (8 см3 — зерно; 4 см3 — зеленая масса, солома) помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.5.

9.4. Очистка на патроне № 2

Аликвоту экстракта почвы, полученную по п. 9.2, количественно переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Промывают патрон 5 см3 воды. Касугамицин элюируют 3 см3 1 № соляной кислоты. Элюат количественно переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см3 и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют на содержание касугамицина по п. 9.6.

9.5. Очистка на патроне № 1

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.3), количественно переносят двумя порциями воды по 1 см3 на подготовленный патрон № 1 (п. 7.2). Промывают патрон 5 см3 воды. Элюаты объединяют, количественно переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см3 и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют на содержание касугамицина по п. 9.6.

9.6. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом для очень полярных и водорастворимых соединений, работающая в режиме гидрофильной жидкостной хроматографии, (50 x 2,1) мм, 1,7 мкм.

Температура колонки (30 +/- 1) °C.

Подвижная фаза: смесь ацетонитрила (A) и 0,005 М ортофосфорной кислоты (B) в градиентном режиме: от 100% к 40% компонента A за 5 мин.

Скорость потока элюента 0,2 см3/мин.

Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм.

Объем вводимой пробы 10 мм3.

Время удерживания касугамицина составляет (4,3 +/- 0,1) мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание касугамицина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = \frac{S_{x} \cdot K \cdot V}{P} ,

где Sх — площадь пика касугамицина на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P — навеска (г) или объем (см3) анализируемой части образца (для воды 200 см3, для почвы 4 г, для зерна 2 г, для соломы и зеленой массы 0,2 г).

Содержание остаточных количеств касугамицина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор касугамицина с концентрацией 10,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq r,

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости, (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг, при вероятности P = 0,95,

где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг.

\Delta = \frac{\delta \times X}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,1 мг/кг*, где * — 0,1 мг/кг — предел обнаружения касугамицина в зерне).»

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},\text{Х}} + \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime},

где \pm \Delta_{\text{л},\text{Х}} ( \pm \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84 \cdot \Delta,

где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \times X}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры Kк рассчитывают по формуле:

Kк = X' — X - Cд,

где X', X, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

K = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}} . (1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Kк) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Kк| <= K, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq R, (3)

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.