МУК 4.1.3290-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств крезоксим-метила в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 28.07.2015)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 28 июля 2015 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КРЕЗОКСИМ-МЕТИЛА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3290-15

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» (В.И. Долженко, А.С. Комарова В.В. Человечкова), ООО «Инновационный центр защиты растений» (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. № 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 июля 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации № 01.5.04.193/01.00043/2015

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств крезоксим-метила в семенах и масле подсолнечника в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Крезоксим-метил.

(E)-метил-2-метоксиимино-2-{2-(o-толилокси-метил)фенил}ацетат (IUPAC).

C₁₈H₁₉NO₄.

Молекулярная масса 313,4.

Химически чистое вещество представляет собой белое кристаллическое вещество со слабым запахом.

Температура плавления: 97,2 — 101,7 °C.

Давление пара при 20 °C: 2,3 x 10-3 мПа.

Растворимость (в г/дм3 при 20 °C): вода — 0,002; гептан — 1,7; толуол — 111, дихлорметан — 939, метанол — 14,9; ацетон — 217, этилацетат — 123.

Стабильность к гидролизу при 20 °C: DT50 34 дня (pH 7), 7 часов (pH 9). В биологически активных почвах в аэробных условиях крезоксим-метил быстро разрушается: DT90 менее 3 дней.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс более 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для крыс превышает 2 000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и сенсибилизирующими свойствами. Не токсичен для пчел, дождевых червей, полезных насекомых и птиц.

Область применения препарата

Синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Вещество эффективно против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков, овощных, кормовых, технических и плодовых культур. Обладает защитным, лечебным и искореняющим действием.

В России для крезоксим-метила в подсолнечнике гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Метод основан на определении крезоксим-метила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов ацетонитрилом, очистки в системе несмешивающихся растворителей и очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация крезоксим-метила проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2 Кондиционирование патронов для твердофазной экстракции

Два патрона соединяют последовательно и промывают 5 см3 смеси № 1, затем 5 см3 гексана.

7.3 Приготовление растворов

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 45:55 по объему, используя мерные цилиндры.

7.3.3. Для приготовления ацетонитрила, насыщенного гексаном, в делительной воронке смешивают ацетонитрил и гексан в соотношении 5:1, встряхивают в течение 2 мин, после разделения слоев нижний ацетонитрильный слой готов к использованию.

7.4 Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску крезоксим-метила (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2 Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями крезоксим-метила 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

7.4.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 2,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,4 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5,0 см3 раствора № 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2,0 см3 раствора № 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1,0 см3 раствора № 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.

При изучении полноты определения крезоксим-метила в семенах и масле подсолнечника используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5 Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация крезоксим-метила в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

C = K·S, где

S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|C - C_{K}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.} , где

C — аттестованное значение массовой концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе,

CK — результат контрольного измерения массовой концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе,

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( \lambda_{\text{контр}.} = 10% при P = 0,95).

7.6 Проверка хроматографического поведения крезоксим-метила

на патронах для твердофазной экстракции

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора крезоксим-метила с концентрацией 1 мкг/см3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см3 гексана и переносят на подготовленные патроны. Колбу обмывают 1 см3 гексана и смыв тоже вносят на патроны. Промывают патроны 10 см3 гексана, элюат отбрасывают. Затем элюируют крезоксим-метил смесью № 1 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

Фракции, содержащие крезоксим-метил, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения крезоксим-метила следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79), а также отбор проб семян подсолнечника для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».

Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

Для исследовательских целей допускается получение масла в день анализа в лаборатории из проб измельченных семян с помощью лабораторного пресса.

9. Проведение определения

9.1 Определение крезоксим-метила

в семенах и масле подсолнечника

Навеску масла или измельченных семян (5 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 и добавляют 40 см3 ацетонитрила. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, центрифугируют при скорости 4 000 об./мин в течение 10 мин, фильтруют через фильтр быстрой фильтрации в круглодонную колбу. К остатку в пробирке добавляют 30 см3 ацетонитрила и проводят повторную экстракцию. Объединенные экстракты упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Остаток переносят в делительную воронку тремя порциями по 10 см3 ацетонитрила, насыщенного гексаном, и дважды промывают гексаном по 10 см3. Ацетонитрильный слой собирают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

9.2 Очистка на двух последовательных патронах

для твердофазной экстракции

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.1.), количественно переносят двумя порциями по 1 см3 гексана на подготовленные патроны (п. 7.2). Промывают патроны 10 см3 гексана. Крезоксим-метил элюируют 5 см3 смеси № 1. Элюат количественно переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см3 и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 0,5 см3 подвижной фазы и анализируют на содержание крезоксим-метила по п. 9.3.

9.3 Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, включающей гидрофильную карбаматную группу в цепи C18, (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 45:55. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 230 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3. Время удерживания крезоксим-метила (5,3 +/- 0,1) мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание крезоксим-метила в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = \frac{S_{x} \cdot K \cdot V}{P} , где

Sx — площадь пика крезоксим-метила на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P — навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств крезоксим-метила в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор крезоксим-метила с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq r , где

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости, (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta),\text{мг}/\text{кг} , при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг.

\Delta = \frac{\delta \times X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг <>, где <> — 0,01 мг/кг — предел обнаружения крезоксим-метила в семенах подсолнечника).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

\text{С}_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X'} , где

\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X'}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84 \cdot \Delta , где

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \times X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:

Кк = X' — X - Cд, где

X', X, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X'}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} (1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Кк| <= К, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq R , где (3)

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.