МУК 4.1.3266-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пирафлуфен-этила в воде, почве, зерне и соломе хлебных злаков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 09.06.2015)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 9 июня 2015 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПИРАФЛУФЕН-ЭТИЛА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ХЛЕБНЫХ ЗЛАКОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3266-15

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ Всероссийский НИИ защиты растений и ООО «Инновационный центр защиты растений» (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская, В.В. Человечкова, А.А. Далинова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. № 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 9 июня 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.190/01.00043/2015 от 12.02.2015.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств пирафлуфен-этила в диапазоне: в воде — 0,001 — 0,01 мг/дм3, в почве и зерне — 0,01 — 0,1 мг/кг, в соломе — 0,05 — 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Пирафлуфен-этил

Ethyl 2-chloro-5-(4-chloro-5-difluoromethoxy-1-methylpyrazol-3-yl)-4-fluorophenoxyacetate (ИЮПАК).

Структурная формула:

Брутто формула: C₁₃H₉Cl₂F₃N₂O₄.

Молекулярная масса: 413,2.

Химически чистое вещество представляет собой белые кристаллы.

Температура плавления: 126,8 °C.

Давление пара при 25 °C: 4,3 x 10-6 МПа.

Растворимость в воде: 0,082 мг/дм3 (при 20 °C).

Растворимость в органических растворителях (г/дм3, при 20 °C): ацетон — 175, метанол — 7,39, этилацетат — 108, ксилол — 43.

Стабильность к гидролизу: стабилен при pH 4, неустойчив при pH 7, DT50 = 13 дней, при pH 9 быстро разрушается.

Период полураспада в почве: DT50 = от 0,5 до 4 дней.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD50 для млекопитающих для крыс > 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD50 для млекопитающих превышает 2 000 мг/кг. Ингаляционная LC50 для крыс более 5,03 мг/м3. Оказывает раздражающее действие на кожу и слизистую глаз. Умеренно токсичен для пчел и почвенных червей.

Область применения препарата. Контактный гербицид; при попадании на растение легко проникает в ткани растения и в присутствии света вызывает быстрый некроз или высушивание стеблей и листьев.

Механизм действия. Ингибитор протопорфириноген-IX оксидазы.

Гигиенические нормативы для пирафлуфен-этила в России не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения пирафлуфен-этила, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Метод основан на определении пирафлуфен-этила методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов ацетонитрилом и очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация пирафлуфен-этила проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2 Кондиционирование патронов

7.2.1 Кондиционирование патрона № 1 с гидрофобным

слабокислотным сорбентом с постоянной активностью

Патрон последовательно промывают 3 см3 смеси № 4, затем 3 см3 гексана.

7.2.2 Кондиционирование патрона № 2 с гидрофобным сорбентом

с привитыми гексадецильными группами

Патрон промывают 3 см3 ацетонитрила, затем 3 см3 воды.

7.3 Приготовление растворов

7.3.1. 0.005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.

7.4 Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску пирафлуфен-этила (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2 Приготовление градуировочных растворов.

Градуировочные растворы с концентрациями пирафлуфен-этила 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 43:57).

7.4.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 7 дней, градуировочные растворы использовать в день приготовления.

При изучении полноты определения пирафлуфен-этила используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5 Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация пирафлуфен-этила в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пирафлуфен-этила в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

C = K S, где

S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|C - C_{K}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.} , где

C — аттестованное значение массовой концентрации пирафлуфен-этила в градуировочном растворе;

Cк — результат контрольного измерения массовой концентрации пирафлуфен-этила в градуировочном растворе;

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).

7.6 Проверка хроматографического поведения пирафлуфен-этила

на патроне № 1

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора пирафлуфен-этила с концентрацией 1 мкг/см3. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см3 гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см3 гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 5 см3 смеси № 3, элюат отбрасывают. Затем элюируют пирафлуфен-этил смесью № 4 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют по п. 9.5.

Фракции, содержащие пирафлуфен-этил, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

7.7 Проверка хроматографического поведения пирафлуфен-этила

на патроне № 2

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора пирафлуфен-этила с концентрацией 1 мкг/см3. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см3 ацетонитрила, добавляют 9 см3 воды и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Промывают патрон 5 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют пирафлуфен-этил смесью № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют по п. 9.5.

Фракции, содержащие пирафлуфен-этил, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения пирафлуфен-этила следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 31861-12 «Вода. Общие требования к отбору проб»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб»; ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна». Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают.

Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

9. Проведение определения

9.1 Экстракция пирафлуфен-этила из воды

На предварительно кондиционированный патрон № 2 наносят 50 см3 воды, патрон промывают 5 см3 смеси № 1. Пирафлуфен-этил элюируют 5 см3 ацетонитрила, элюат собирают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.2 Экстракция пирафлуфен-этила из почвы, зерна и соломы

Навеску измельченного зерна (10 г), почвы (10 г) или соломы (2 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, добавляют 10 см3 ацетонитрила, воду (для почвы — 5 см3, для зерна и соломы — 10 см3), 4 г безводного серно-кислого натрия, 1 г безводного уксусно-кислого натрия, 1 г натрия хлористого, 0,1 см3 ледяной уксусной кислоты, пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают аликвоту 5 см3, переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °C. Сухой остаток подвергают очистке на патронах по пп. 9.3 - 9.4.

9.3 Очистка на патроне № 2

Сухой остаток, полученный по п. 9.2, растворяют в 1 см3 ацетонитрила, добавляют 9 см3 воды и наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2). Патрон промывают 5 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Пирафлуфен-этил элюируют 5 см3 смеси № 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °C, остаток подвергают очистке на патроне № 1 по п. 9.4.

9.4 Очистка на патроне № 1

Сухой остаток, полученный по п. 9.3, растворяют в 1 см3 гексана, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2). Колбу ополаскивают еще 1 см3 гексана, который также наносят на патрон. Патрон промывают 5 см3 смеси № 3, элюат отбрасывают. Пирафлуфен-этил элюируют 4 см3 смеси № 4, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °C, остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.5 Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, полностью закрытыми и связанными этиленгибридными мостиками, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм.

Температура колонки: (30 +/- 1) °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 50:50.

Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин.

Рабочая длина волны УФ-детектора: 242 нм.

Объем вводимой пробы: 10 мм3.

Время удерживания пирафлуфен-этила: 11,8 +/- 0,1 мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание пирафлуфен-этила в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = \frac{S_{x} \cdot K \cdot V \cdot n \cdot 100}{P \cdot f} , где

Sx — площадь пика пирафлуфен-этила на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P — навеска анализируемого образца, г;

f — полнота извлечения пирафлуфен-этила, приведенная в табл. 2, %;

n — коэффициент, учитывающий отбор аликвоты экстракта.

Содержание остаточных количеств пирафлуфен-этила в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пирафлуфен-этила с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,01 мг/кг <>, где <> — 0,01 мг/кг — предел обнаружения пирафлуфен-этила в зерне).»

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

\text{С}_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X'} , где

\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X'}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:

Кк = X' — X - Cд, где

X', X, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X'}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} (2)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Кк| <= К, (3)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , где (4)

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.