---
title: "\"МУК 4.1.3244-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств моксидектина в молоке и мясе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания\""
number: "МУК 4.1.3244-14"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/muk-4-1-3244-14"
---

## "МУК 4.1.3244-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств моксидектина в молоке и мясе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"

# "МУК 4.1.3244-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств моксидектина в молоке и мясе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"

(утв. Роспотребнадзором 29.12.2014)


<a id="p100001"></a>Утверждаю
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный врач
Российской Федерации
**А.Ю.ПОПОВА**
29 декабря 2014 года


#### <a id="p100002"></a>4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


<a id="p100003"></a>**ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ МОКСИДЕКТИНА В МОЛОКЕ**
**И МЯСЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ**

<a id="p100004"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.1.3244-14**

1. <a id="p100005"></a>Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова, В.Н. Волкова).
2. <a id="p100006"></a>Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. N 2).
3. <a id="p100007"></a>Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2014 г.
4. <a id="p100008"></a>Введены впервые.

<a id="p100009"></a>Свидетельство об аттестации N РОСС RU.0001.310430/0198.14.07.14 от 14.07.2014.

<a id="p100010"></a>Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации моксидектина в молоке и мясе в диапазоне 0,005 - 0,10 мг/кг.
<a id="p100011"></a>Методические указания носят рекомендательный характер.
<a id="p100012"></a>Моксидектин
<a id="p100013"></a>(10E,14E,16E)-(1R,4S,5'S,6R,6'S,8R13R20R,21R,24S)-6'-[(1E)-1,3-диметилбут-1-енил]-21,24-дигидрокси-5',11,13,22-тетраметил-(3,7,19-триоксатетрацикло [15.6.1.14,8.020,24] пентакоза-10,14,16,22-тетраен)-6-спиро-2'-(тетрагидропиран)-2,4'-дион4'-(E)-(O-метилоксим) (ИЮПАК).
<a id="p100014"></a>Структурная формула:

<a id="p100015"></a> ![рис. 1](https://i.bukva.ai/KPsTxntZ/img_0.png) 

<a id="p100016"></a>Брутто формула: C<sub>37</sub>H<sub>53</sub>NO<sub>8</sub>.
<a id="p100017"></a>Молекулярная масса 639,82.
<a id="p100018"></a>Белое или светло-желтое кристаллическое вещество. Температура плавления 145 - 154 °C. Хорошо растворим в полярных органических растворителях. Растворимость в воде 0,51 мг/дм3. Моксидектин - слабое основание, pKa < 2.
<a id="p100019"></a>Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс > 106 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для кроликов > 2 000 мг/кг.
<a id="p100020"></a>Область применения препарата. Моксидектин - полусинтетический ветеринарный препарат, обладающий инсектицидной активностью широкого спектра, рекомендуется к применению в качестве антипаразитарного и антигельминтного препарата для сельскохозяйственных животных.


## 1. <a id="p100021"></a>Метрологические характеристики


<a id="p100022"></a>При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в [табл. 1](#p100024) для соответствующих диапазонов концентраций.

<a id="p100023"></a>Таблица 1

<a id="p100024"></a>Метрологические параметры


| <a id="p100025"></a>Анализируемый объект | <a id="p100026"></a>Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | <a id="p100027"></a>Показатель точности (границы относительной погрешности, P = 0,95), $\pm \delta$ , % | <a id="p100028"></a>Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), $\sigma_{r}$ , % | <a id="p100029"></a>Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), $\sigma_{R}$ , % | <a id="p100030"></a>Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, % | <a id="p100031"></a>Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), R, % (P = 0,95) |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| <a id="p100032"></a>Молоко | <a id="p100033"></a>0,005 - 0,1 | <a id="p100034"></a>50 | <a id="p100035"></a>7,2 | <a id="p100036"></a>10,1 | <a id="p100037"></a>20 | <a id="p100038"></a>28 |
| <a id="p100039"></a>Мясо | <a id="p100040"></a>0,005 - 0,1 | <a id="p100041"></a>50 | <a id="p100042"></a>8,2 | <a id="p100043"></a>11,5 | <a id="p100044"></a>23 | <a id="p100045"></a>32 |


<a id="p100046"></a>Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в [табл. 2](#p100048).

<a id="p100047"></a>Таблица 2

<a id="p100048"></a>Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата


<table>
<colgroup><col width="13%"><col width="14%"><col width="19%"><col width="17%"><col width="16%"><col width="21%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100049"></a>Анализируемый объект</td><td colspan="5"><a id="p100050"></a>Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20</td></tr>
<tr><td><a id="p100051"></a>предел обнаружения, мг/кг</td><td><a id="p100052"></a>диапазон определяемых концентраций, мг/кг</td><td><a id="p100053"></a>средняя полнота извлечения, %</td><td><a id="p100054"></a>стандартное отклонение, %</td><td><a id="p100055"></a>доверительный интервал среднего результата, %</td></tr>
<tr><td><a id="p100056"></a>Молоко</td><td><a id="p100057"></a>0,005</td><td><a id="p100058"></a>0,005 - 0,1</td><td><a id="p100059"></a>96,3</td><td><a id="p100060"></a>5,1</td><td><a id="p100061"></a>+/- 2,7</td></tr>
<tr><td><a id="p100062"></a>Мясо</td><td><a id="p100063"></a>0,005</td><td><a id="p100064"></a>0,005 - 0,1</td><td><a id="p100065"></a>87,8</td><td><a id="p100066"></a>7,1</td><td><a id="p100067"></a>+/- 3,8</td></tr>
</table>



## 2. <a id="p100068"></a>Метод измерений


<a id="p100069"></a>Методика основана на определении моксидектина с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектором после извлечения вещества из анализируемой пробы молока и мяса ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, превращения моксидектина во флуорогенное производное. Экстракты мяса после дериватизации подвергают дополнительной очистке на патроне для твердофазной экстракции на основе силикагеля.
<a id="p100070"></a>Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.


## 3. <a id="p100071"></a>Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы



#### <a id="p100072"></a>3.1 Средства измерений



| <a id="p100073"></a>Жидкостный хроматограф с флуориметрическим детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки |  |
| --- | --- |
| <a id="p100074"></a>Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | <a id="p100075"></a>ГОСТ Р 53228-08 |
| <a id="p100076"></a>Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г, класс точности высокий (II) | <a id="p100077"></a>ГОСТ Р 53228-08 |
| <a id="p100078"></a>Колбы мерные вместимостью 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2, 2-1000-2 | <a id="p100079"></a>[ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) |
| <a id="p100080"></a>Меры массы | <a id="p100081"></a>ГОСТ 7328-01 |
| <a id="p100082"></a>Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3 | <a id="p100083"></a>[ГОСТ 29227-91](https://bukva.ai/docs/gost-29227-91) |
| <a id="p100084"></a>Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой вместимостью 5 и 10 см3 | <a id="p100085"></a>[ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) |
| <a id="p100086"></a>Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100, 250, 500 и 1 000 см3 | <a id="p100087"></a>[ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) |


<a id="p100088"></a>*Примечание.* Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.


#### <a id="p100089"></a>3.2 Реактивы



| <a id="p100090"></a>Моксидектин, аналитический стандарт с содержанием основного компонента 97,4% |  |
| --- | --- |
| <a id="p100091"></a>Ацетонитрил для хроматографии, хч | <a id="p100092"></a>ТУ 6-09-4326-76 |
| <a id="p100093"></a>Вода для лабораторного анализа (деионизованная, бидистиллированная) | <a id="p100094"></a>[ГОСТ Р 52501-05](https://bukva.ai/docs/gost-r-52501-2005) |
| <a id="p100095"></a>н-Гексан (гексан), для хроматографии | <a id="p100096"></a>ТУ 6-09-06-657-84 |
| <a id="p100097"></a>Калий углекислый (карбонат калия, поташ), хч, прокаленный | <a id="p100098"></a>[ГОСТ 4221-76](https://bukva.ai/docs/standart-gost-4221-76) |
| <a id="p100099"></a>Кислота серная концентрированная, хч | <a id="p100100"></a>ГОСТ 4204-77 |
| <a id="p100101"></a>Кислота ортофосфорная, хч, 85% | <a id="p100102"></a>ГОСТ 6552-80 |
| <a id="p100103"></a>Метиловый спирт (метанол), хч | <a id="p100104"></a>[ГОСТ 6995](https://bukva.ai/docs/standart-gost-6995-77) |
| <a id="p100105"></a>1-N-метилимидазол, для синтеза, чистота >= 99% |  |
| <a id="p100106"></a>Патроны концентрирующие для твердофазной экстракции, 360 мг сорбента на основе силикагеля |  |
| <a id="p100107"></a>Трифторуксусный ангидрид, чистота >= 98,0% |  |
| <a id="p100108"></a>Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид фосфора), хч | <a id="p100109"></a>ТУ 6-09-4173-85 |


<a id="p100110"></a>*Примечание.* Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.


#### <a id="p100111"></a>3.3 Вспомогательные средства измерений,

устройства и материалы


<table>
<colgroup><col width="73%"><col width="27%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100112"></a>Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100113"></a>Аппарат для встряхивания, орбита до 10 мм</td><td><a id="p100114"></a>ТУ 64-1-2851-78</td></tr>
<tr><td><a id="p100115"></a>Баня ультразвуковая с рабочей частотой 35 кГц</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100116"></a>Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 - 790 мм рт. ст.</td><td><a id="p100117"></a>ТУ 2504-1799-75</td></tr>
<tr><td><a id="p100118"></a>Воронка делительная вместимостью 250 см3</td><td><a id="p100119"></a><a href="https://bukva.ai/docs/standart-gost-9737-93">ГОСТ 9737-93</a></td></tr>
<tr><td><a id="p100120"></a>Воронки стеклянные конусные диаметром 36 - 40 мм и 56 - 60 мм</td><td><a id="p100121"></a>ГОСТ 25336-82</td></tr>
<tr><td><a id="p100122"></a>Гигрометр с диапазоном измерений относительной влажности от 30 до 90%</td><td><a id="p100123"></a>ТУ 25-11-1645-84</td></tr>
<tr><td><a id="p100124"></a>Гомогенизатор</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100125"></a>Груша резиновая</td><td><a id="p100126"></a>ТУ 9398-05-0576-9082-03</td></tr>
<tr><td><a id="p100127"></a>Колбы конические (плоскодонные) с пришлифованной пробкой вместимостью 250 - 300 см3</td><td><a id="p100128"></a>ГОСТ 23932-90</td></tr>
<tr><td><a id="p100129"></a>Колбы круглодонные на шлифе (для упаривания) вместимостью 50, 150 и 250 см3</td><td><a id="p100130"></a><a href="https://bukva.ai/docs/standart-gost-9737-93">ГОСТ 9737-93</a></td></tr>
<tr><td><a id="p100131"></a>Мембраны микропористые капроновые, размер пор 0,45 мкм</td><td><a id="p100132"></a>ТУ 9471-002-10471723-03</td></tr>
<tr><td><a id="p100133"></a>Набор для фильтрации растворителей через мембрану</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100134"></a>Насос водоструйный вакуумный</td><td><a id="p100135"></a>ГОСТ 25336-82</td></tr>
<tr><td><a id="p100136"></a>Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 30</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100137"></a>Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100138"></a>Стаканы химические вместимостью 100 и 400 см3</td><td><a id="p100139"></a>ГОСТ 25336-82</td></tr>
<tr><td><a id="p100140"></a>Стекловата</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100141"></a>Стеклянные палочки</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100142"></a>Термометр с диапазоном измерений от 0 до 55 °C и ценой деления 0,1 °C</td><td><a id="p100143"></a><a href="https://bukva.ai/docs/gost-28498-90">ГОСТ 28498-90</a></td></tr>
<tr><td><a id="p100144"></a>Установка для перегонки растворителей</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100145"></a>Холодильник водяной обратный</td><td><a id="p100146"></a><a href="https://bukva.ai/docs/standart-gost-9737-93">ГОСТ 9737-93</a></td></tr>
<tr><td><a id="p100147"></a>Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 5 мкм; предколонка стальная длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 5 мкм</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100148"></a>Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 - 100 мм3</td><td></td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100149"></a><a id="p100150"></a>Шприц медицинский инъекционный однократного применения вместимостью 5 и 10 см3<br>ГОСТ 24861-91 (ИСО 7886-84)</td></tr>
<tr><td></td><td><a id="p100151"></a>Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.</td></tr>
</table>



## 4. <a id="p100152"></a>Требования безопасности


<a id="p100153"></a>4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
<a id="p100154"></a>4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.


## 5. <a id="p100155"></a>Требования к квалификации оператора


<a id="p100156"></a>К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой имеющего опыт работы на жидкостном хроматографе и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по [п. 13](#p100252).


## 6. <a id="p100157"></a>Условия измерений


<a id="p100158"></a>При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- <a id="p100159"></a>процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- <a id="p100160"></a>выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.


## 7. <a id="p100161"></a>Подготовка к выполнению измерений


<a id="p100162"></a>Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление реактива для дериватизации, градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка патронов для очистки экстрактов.


#### <a id="p100163"></a>7.1 Очистка органических растворителей



##### <a id="p100164"></a>7.1.1 Ацетонитрил


<a id="p100165"></a>Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм3 ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм3 ацетонитрила 10 г карбоната калия).

<a id="p100166"></a>7.1.2. н-Гексан

<a id="p100167"></a>Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.


#### <a id="p100168"></a>7.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ



##### <a id="p100169"></a>7.2.1 Приготовление 0,1%-го раствора ортофосфорной кислоты.

<a id="p100170"></a>В мерную колбу вместимостью 500 см3 помещают 250 - 300 м3 деионизованной воды, вносят 0,5 см3 ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

##### <a id="p100171"></a>7.2.2 Приготовление подвижной фазы.

<a id="p100172"></a>В мерную колбу вместимостью 1 000 см3 помещают 950 см3 ацетонитрила и 50 см3 0,1%-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.
<a id="p100173"></a>Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 30 дней.


#### <a id="p100174"></a>7.3 Приготовление реактива для дериватизации


<a id="p100175"></a>Смешивают трифторуксусный ангидрид и свежеперегнанный ацетонитрил в объемном соотношении 1:2. Реактив годен в течение рабочего дня.


#### <a id="p100176"></a>7.4 Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ


<a id="p100177"></a>Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по [п. 7.2](#p100168).) при скорости подачи растворителя 1,0 см3/мин до установления стабильной базовой линии.


#### <a id="p100178"></a>7.5 Приготовление градуировочных растворов

и раствора внесения

<a id="p100179"></a>7.5.1. Исходный раствор моксидектина для градуировки (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,0100 г моксидектина, растворяют в 50 - 60 см3 ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.
<a id="p100180"></a>Раствор хранят в холодильнике (защищенном от света месте) при температуре 5 °C в течение месяца.
<a id="p100181"></a>Растворы N 1 - 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.
<a id="p100182"></a>7.5.2. Раствор N 1 моксидектина для градуировки и внесения (концентрация 1 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 1 см3 исходного раствора моксидектина с концентрацией 100 мкг/см3 [(п. 7.5.1)](#p100179), разбавляют ацетонитрилом до метки.
<a id="p100183"></a>Раствор хранят в холодильнике (защищенном от света месте) при температуре (4 +/- 2) °C в течение месяца.
<a id="p100184"></a>Этот раствор используют для приготовления проб мяса и молока с внесением моксидектина при оценке полноты извлечения вещества методом "внесено-найдено", а также контроле качества результатов измерений методом добавок.
<a id="p100185"></a>7.5.3. Рабочие растворы N 2 - 6 моксидектина для градуировки (концентрация 0,005 - 0,1 мкг/см3). В 5 мерных колб вместимостью 100 см3 помещают по 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 и 10 см3 градуировочного раствора N 1 с концентрацией 1 мкг/см3 [(п. 7.5.2)](#p100182), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 6 с концентрацией моксидектина 0,005, 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/см3 соответственно.
<a id="p100186"></a>Растворы хранят в холодильнике (защищенном от света месте) при температуре (4 +/- 2) °C в течение месяца.
<a id="p100187"></a>7.5.4. Рабочие растворы N 2а - 6а флуорогенного производного моксидектина для градуировки (соответствуют содержанию моксидектина 0,005 - 0,1 мкг). В 5 градуированных пробирок вместимостью 5 см3 вносят по 1 см3 каждого из 5 рабочих растворов моксидектина N 2 - 6 [(п. 7.5.3)](#p100185), прибавляют по 0,1 см3 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 - 5 °C, помещая пробирки в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 см3 реактива для дериватизации (приготовленного по [п. 7.3](#p100174)), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку вносят по 2 см3 ацетонитрила, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2а - 6а флуорогенного производного с содержанием моксидектина 0,005, 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг соответственно.
<a id="p100188"></a>Растворы хранят в холодильнике (защищенном от света месте) при температуре (4 +/- 2) °C в течение месяца. Срок хранения растворов при комнатной температуре в темноте - не более суток.


#### <a id="p100189"></a>7.6 Установление градуировочной характеристики


<a id="p100190"></a>Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (единицы люминесценции - ЕЛ·с) от содержания моксидектина в растворе (мкг), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам флуорогенного производного моксидектина N 2а - 6а для градуировки.
<a id="p100191"></a>В инжектор хроматографа вводят по 50 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по [п. 9.4](#p100213). Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.


#### <a id="p100192"></a>7.7 Подготовка патрона для очистки экстрактов


<a id="p100193"></a>Патрон для твердофазной экстракции устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума [<*>](#p100195), сверху в патрон вставляют шприц с разъемом Льюера объемом не менее 10 см3, используемый в качестве емкости для элюента.

<a id="p100194"></a>

---

<a id="p100195"></a><*> В отсутствие специального аллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью шприца медицинского, скорость продавливания раствора не должна превышать 1 - 2 капли в секунду.

<a id="p100196"></a>Концентрирующий патрон промывают 5 см3 метанола, высушивают пропусканием воздуха (с использованием вакуума) в течение 5 мин. Затем через патрон пропускают 5 см3 гексана. Процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин, при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.


## 8. <a id="p100197"></a>Отбор и хранение проб


<a id="p100198"></a>Отбор проб продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ на исследуемые продукты: [ГОСТ 7269-79](https://bukva.ai/docs/gost-7269-79) "Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести", [ГОСТ 3622-68](https://bukva.ai/docs/gost-3622-68) "Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка их к испытанию".
<a id="p100199"></a>Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы анализируют непосредственно после отбора проб или хранят в морозильной камере при -20 °C.
<a id="p100200"></a>Перед анализом образцы мяса массой 200 - 300 г тщательно измельчают с использованием гомогенизатора. Пробу гомогенизированного образца массой 10 г, а также молока массой 5 г взвешивают на аналитических весах в плоскодонных колбах вместимостью 250 см3.


## 9. <a id="p100201"></a>Выполнение определения



#### <a id="p100202"></a>9.1 Экстракция


<a id="p100203"></a>К пробе гомогенизированного образца мяса массой 10 г или молока массой 5 г, помещенной в колбу вместимостью 250 см3, приливают 100 см3 ацетонитрила, тщательно перемешивают путем встряхивания, выдерживают на ультразвуковой бане 5 мин, помещают на встряхиватель на 30 мин, дополнительно выдерживают на ультразвуковой бане 5 мин и снова помещают на встряхиватель на 30 мин.
<a id="p100204"></a>Колбы с экстрактами помещают на 30 мин в морозильную камеру. Затем надосадочную жидкость переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, фильтруя ее через тампон из стекловаты, помещенный в конусную химическую воронку. Добавляют 70 см3 гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой сливают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °C. Сухой остаток растворяют в смеси 14 см3 ацетонитрила и 56 см3 воды, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 70 см3 гексана, интенсивно встряхивают воронку в течение 1 мин. Верхний органический слой собирают в круглодонную колбу вместимостью 250 см3. Водно-ацетонитрильную фазу вновь переносят в делительную воронку и повторяют операцию экстракции, используя 70 см3 гексана.
<a id="p100205"></a>Объединенную органическую фазу упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °C. Сухой остаток растворяют в 5 см3 ацетонитрила. Аликвоту раствора объемом 1 см3, (1/5 часть пробы, эквивалентная 1 г молока и 2 г мяса) переносят в градуированную пробирку на 5 см3 и подвергают дериватизации по [п. 9.2](#p100206).


#### <a id="p100206"></a>9.2 Дериватизация


<a id="p100207"></a>К ацетонитрильному раствору прибавляют 0,1 см3 l-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 - 5 °C, помещая колбу в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 см3 реактива для дериватизации [(п. 7.3)](#p100174), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре. Затем в пробирку вносят по 2 см3 ацетонитрила, тщательно перемешивают.
<a id="p100208"></a>Дериватизированные экстракты проб молока анализируют в условиях хроматографирования по [п. 9.4](#p100213).
<a id="p100209"></a>Дериватизированные экстракты проб мяса подвергают дополнительной очистке по [п. 9.3](#p100210).


#### <a id="p100210"></a>9.3 Очистка экстракта


<a id="p100211"></a>Аликвоту раствора после дериватизации объемом 1,7 см3 переносят в градуированную пробирку вместимостью 10 см3, добавляют 5 см3 гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, верхний гексановый слой отбирают с помощью пипетки, перенося в колбу вместимостью 25 см3, операцию экстракции повторяют новой порцией гексана объемом 5 см3. Верхний гексановый слой также переносят в колбу, объединяя с первым экстрактом. Объединенный гексановый экстракт вносят на патрон для твердофазной экстракции, подготовленный по [п. 7.7](#p100192). Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1 - 2 капли в секунду. Элюат собирают непосредственно в круглодонную колбу.
<a id="p100212"></a>Флуорогенное производное моксидектина дополнительно элюируют с патрона 5 см3 гексана, также объединяя элюат с первой порцией в круглодонной колбе. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C. Остаток в колбе растворяют в 1,7 см3 ацетонитрила и анализируют на содержание моксидектина по [п. 9.4](#p100213).


#### <a id="p100213"></a>9.4 Условия хроматографирования


<a id="p100214"></a>Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.
<a id="p100215"></a>Жидкостный хроматограф с флуориметрическим детектором с переменной длиной волны, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником, термостатом колонки.


| <a id="p100216"></a>Длина волны: | <a id="p100217"></a>возбуждение 365 нм; |
| --- | --- |
|  | <a id="p100218"></a>эмиссия 470 нм. |


<a id="p100219"></a>Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 5 мкм.
<a id="p100220"></a>Температура колонки: 35 °C.
<a id="p100221"></a>Скорость потока элюента: 1,0 см3/мин.
<a id="p100222"></a>Объем вводимой пробы: 50 мм3.
<a id="p100223"></a>Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1% ортофосфорная кислота (95:5, по объему).
<a id="p100224"></a>Линейный диапазон детектирования 0,25 - 2,5 нг.
<a id="p100225"></a>Пробу вводят в инжектор хроматографа. Устанавливают площадь пика флуорогенного производного моксидектина.
<a id="p100226"></a>Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор флуорогенного производного моксидектина с содержанием 0,1 мкг, разбавляют ацетонитрилом (не более чем в 50 раз).


## 10. <a id="p100227"></a>Обработка результатов анализа


<a id="p100228"></a>Содержание моксидектина в пробах (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

<a id="p100229"></a> $X = \frac{S_{\text{пр}.} \cdot C \cdot D}{S_{\text{ст}.} \cdot m}$ , где

<a id="p100230"></a>Sпр. - площадь пика флуорогенного производного моксидектина в анализируемом образце (ЕЛ * с);
<a id="p100231"></a>C - содержание моксидектина в градуировочном растворе, мкг;
<a id="p100232"></a>Sпр. - площадь пика флуорогенного производного моксидектина в градуировочном растворе (ЕЛ * с);
<a id="p100233"></a>m - масса анализируемого образца, г;
<a id="p100234"></a>D - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, D = 5 (молоко); D = 10 (мясо).


## 11. <a id="p100235"></a>Проверка приемлемости результатов параллельных определений


<a id="p100236"></a>За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

<a id="p100237"></a> $\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r$ , где (1)

<a id="p100238"></a>X<sub>1</sub>, X<sub>2</sub> - результаты параллельных определений, мг/кг;
<a id="p100239"></a>r - значение предела повторяемости [(табл. 1)](#p100024), при этом $r = 2,8\sigma_{r}$ .
<a id="p100240"></a>При невыполнении [условия (1)](#p100237) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.


## 12. <a id="p100241"></a>Оформление результатов


<a id="p100242"></a>Результат анализа представляют в виде:

<a id="p100243"></a> $(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг}$ при вероятности P = 0,95, где

<a id="p100244"></a> $\overline{X}$ - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
<a id="p100245"></a> $\Delta$ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

<a id="p100246"></a> $\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100}$ , где

<a id="p100247"></a> $\delta$ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, [табл. 1](#p100024)), %.
<a id="p100248"></a>Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
<a id="p100249"></a>"содержание моксидектина в пробах молока и мяса - менее 0,005 мг/кг" [<*>](#p100251).

<a id="p100250"></a>

---

<a id="p100251"></a><*> - 0,005 мг/кг - предел обнаружения.


## 13. <a id="p100252"></a>Контроль качества результатов измерений


<a id="p100253"></a>Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с [ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-2-2002) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

#### <a id="p100254"></a>13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики.

<a id="p100255"></a>Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
<a id="p100256"></a>При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание моксидектина в которых должно охватывать весь диапазон от 0,005 до 0,1 мкг.
<a id="p100257"></a>Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого градуировочного раствора, используемого для контроля, сохраняется соотношение:

<a id="p100258"></a> $A = \frac{|X - C| \cdot 100}{C} \leq B$ , где (2)

<a id="p100259"></a>X - содержание моксидектина в пробе при контрольном измерении, мкг;
<a id="p100260"></a>C - известное содержание моксидектина в градуировочном растворе, взятом для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг;
<a id="p100261"></a>B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).
<a id="p100262"></a>Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флуорогенного производного моксидектина, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно [п. 7.6](#p100189).
<a id="p100263"></a>Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
<a id="p100264"></a>13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
<a id="p100265"></a>Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

<a id="p100266"></a> $C_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime}$ , где

<a id="p100267"></a> $\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime})$ - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг.
<a id="p100268"></a>Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения $\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta$ с последующим уточнением по мере накопления информации:

<a id="p100269"></a> $\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta$ , где

<a id="p100270"></a> $\Delta$ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

<a id="p100271"></a> $\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100}$ , где

<a id="p100272"></a> $\delta$ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, [табл. 1](#p100024)), %.
<a id="p100273"></a>Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры Кк с нормативом контроля К.
<a id="p100274"></a>Результат контрольной процедуры Кк рассчитывают по формуле:

<a id="p100275"></a> $\text{К}_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - C_{\text{д}}$ , где

<a id="p100276"></a> $\overline{X}\prime$ , $\overline{X}$ , Cд - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по [п. 11](#p100235)) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
<a id="p100277"></a>Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

<a id="p100278"></a> $\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}}$ 

<a id="p100279"></a>Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
<a id="p100280"></a>Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию

<a id="p100281"></a>|Кк| <= К, (3)

<a id="p100282"></a>процедуру анализа признают удовлетворительной.
<a id="p100283"></a>При невыполнении [условия (3)](#p100281) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении [условия (3)](#p100281) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
<a id="p100284"></a>13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
<a id="p100285"></a>Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

<a id="p100286"></a> $\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R$ , где (4)

<a id="p100287"></a>X<sub>1</sub>, X<sub>2</sub> - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;
<a id="p100288"></a>R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, [табл. 1](#p100024)), %.



<a id="p100289"></a>

---