МУК 4.1.3243-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств цифлуфенамида в винограде и виноградном соке методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 29.12.2014)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 декабря 2014 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЦИФЛУФЕНАМИДА В ВИНОГРАДЕ И ВИНОГРАДНОМ СОКЕ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3243-14

1. Разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, М.В. Ларькина, С.К. Рогачева).»

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 ноября 2014 г. № 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2014 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации МВИ № РОСС RU.0001.310430/0199.14.07.14 от 14.07.14.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для измерения концентрации цифлуфенамида в винограде (ягоды, сок) в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Цифлуфенамид

Химический класс: амиды.

(Z)-N-[ \alpha -(циклопропилметоксиимино)-2,3-дифтор-6-(трифторметил)бензил]-2-фенилацетамид (IUPAC).

Структурная формула:

Брутто формула: C₂₀H₁₇F₅N₂O₂.

Молекулярная масса: 412,4.

Белый порошок со слабым сладковатым запахом. Температура плавления 61,5 — 62,5 °C. Давление паров 1,2·10-8 Па (при 20 °C). Растворимость в воде 3,3 мг/дм3 (при 25 °C). Коэффициент распределения н-октан/вода KowlogP = 4,7 (при 20 °C). Стабильность в водных растворах: при pH 3 — 5, 7, 10, при 20 °C, в том числе при низких концентрациях (менее 1 мг/дм3). Стабилен при pH 3 — 5, 7.

Растворимость в органических растворителях (г/дм3): дихлорметан -> 331, хлороформ -> 372, ацетон -> 198 (при 20 °C).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс > 5 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для крыс > 2 000 мг/кг, острая ингаляционная токсичность (LK50) для крыс > 4,76 мг/дм3.

Область применения. Цифлуфенамид — системный фунгицид с длительным профилактическим и выраженным лечебным действием против широкого спектра патогенов грибной этиологии.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

2. Метод измерений

Метод основан на определении цифлуфенамида с использованием капиллярной газожидкостной хроматографии с электронозахватным детектором и/или масс-селективным детекторами после извлечения вещества из анализируемых образцов ацетонитрилом, очистки экстрактов на патроне для твердофазной экстракции с привитой октадецильной фазой.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

3.2. Реактивы

3.3. Вспомогательные средства измерений, устройства, материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе на должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением», ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, прошедших обучение, освоивших методику, владеющих техникой, имеющих опыт работы на газовом хроматографе и подтвердивших соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов и раствора внесения, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для экстракции и очистки экстрактов на концентрирующем патроне, подготовка концентрирующего патрона, проверка хроматографического поведения цифлуфенамида на нем.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Этилацетат

7.1.2.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают. Раствор хранят в стеклянной посуде в течение 3 месяцев.

7.1.2.2. Очистка растворителя. Этилацетат промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. Растворитель хранят в стеклянной посуде в течение 1 месяца.

7.1.2. Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм3 ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм3 ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.2. Приготовление градуировочных растворов и раствора внесения

7.2.1. Исходный раствор цифлуфенамида для градуировки (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,01 г цифлуфенамида, растворяют в 50 — 60 см3 этилацетата, доводят им до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °C в течение месяца.

7.2.2. Рабочий раствор № 1 цифлуфенамида для градуировки и внесения (концентрация 1,0 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 1,0 см3 исходного градуировочного раствора с концентрацией 100,0 мкг/см3 (п. 7.2.1), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор № 1 с концентрацией цифлуфенамида 1,0 мкг/см3.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °C в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено-найдено» и контроля качества результатов измерений методом добавок.

7.2.3. Рабочие растворы № 2 — 5 цифлуфенамида для градуировки (концентрация 0,005 — 0,05 мкг/см3). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 см3 рабочего раствора № 1 для градуировки и внесения раствора с концентрацией 1,0 мкг/см3 (п. 7.2.2), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрациями цифлуфенамида 0,005; 0,01, 0,025 и 0,05 мкг/см3.

Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °C в течение 14 дней.

7.3 Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации цифлуфенамида в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В испаритель хроматографа вводят по 1 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков цифлуфенамида.

7.4. Подготовка концентрирующего патрона

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума и промывают последовательно 10 см3 этилацетата, 10 см3 метанола и 10 см3 бидистиллированной воды. Скорость потока растворителей через патрон не должна превышать 2 см3/мин, при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона. Патрон готовят непосредственно перед использованием.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными: ГОСТ 25896-83 «Виноград свежий столовый. Технические условия»; «Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб»; «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы винограда хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 7 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C. Перед анализом пробы измельчают с помощью гомогенизатора.

Пробы сока анализируют в день изготовления.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

9.1.1. Виноград

Образец измельченных ягод винограда массой 10 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 см3, добавляют 30 см3 деионизованной воды, интенсивно встряхивают 2 — 3 минуты, затем добавляют 80 см3 ацетонитрила и выдерживают на аппарате для встряхивания 30 мин. Смесь отфильтровывают на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через бумажный фильтр средней плотности. Растительный остаток промывают 40 см3 ацетонитрила. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера.

Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр объемом 250 см3 и доводят до метки 150 см3 ацетонитрилом. Переносят аликвоту, равную 1/10 части экстракта (15 см3) в колбу для упаривания и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C досуха.

К сухому остатку добавляют 1 см3 метанола, помещая его на ультразвуковую баню на 30 с, затем добавляют 9 см3 деионизованной воды. После повторного смешивания на ультразвуковой бане экстракт подвергают очистке на концентрирующем патроне по п. 9.2.

9.1.2. Виноградный сок

К образцу сока с мякотью массой 10 г, находящемуся в конической колбе (с пришлифованной пробкой) вместимостью 250 см3, добавляют 10 см3 деионизованной воды, интенсивно встряхивают в течение 5 мин, добавляют 70 см3 ацетонитрила, еще раз встряхивают и помещают в холодильник (4 °C) на 1 — 2 часа. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр средней плотности под вакуумом, промывая остаток на фильтре 10 см3 ацетонитрила.

Экстракты объединяют и помещают в мерный цилиндр объем 100 см3. Доводят объем объединенного отфильтрованного экстракта до метки, отбирают 10 см3 (1/10 часть) экстракта и переносят в колбу для упаривания, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C досуха. К сухому остатку добавляют 1 см3 метанола, помещая его на ультразвуковую баню на 30 с, затем добавляют 9 см3 деионизованной воды. После повторного смешивания на ультразвуковой бане экстракт подвергают очистке на концентрирующем патроне по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта на концентрирующем патроне

Экстракт, полученный по п. 9.1.1 или 9.1.2 (1 см3 метанола и 9 см3 воды) наносят на подготовленный по п. 7.4 концентрирующий патрон со скоростью не более 2 см3/мин, элюат отбрасывают. Действующее вещество смывают 10 см3 метанола, собирают элюат в колбу для упаривания, упаривают досуха при температуре не выше 40 °C, сухой остаток растворяют в 2 см3 этилацетата и хроматографируют в условиях, изложенных в п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

9.3.1 Газовый хроматограф, снабженный электронозахватным

детектором с пределом детектирования по линдану 5·10-14 г/с

Хроматографическая, капиллярная, кварцевая колонка, длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, содержащая сорбент: 5% — фенилполисилоксан, 95% — диметилполисилоксан (толщина пленки сорбента 0,25 мкм).

Температура детектора: 300 °C;

испарителя: 280 °C.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура — 160 °C, выдержка 2 мин, нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 240 °C, выдержка 2 мин, затем нагрев колонки со скоростью 20 градусов в минуту до температуры 270 °C.

Газ 1 (азот): давление 85 кПа, скорость 38,123 см/с, поток 1,85 см3/мин.

Газ 2: деление потока 1:3; сброс 5,5 см3/мин, с 1 мин — 20,0 см3/мин.

Хроматографируемый объем: 1 мм3.

Линейный диапазон детектирования: 0,005 — 0,05 нг.

9.3.2. Хроматограф газовый с масс-селективным детектором (метод подтверждения)

Хроматографическая, капиллярная, кварцевая колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащая сорбент: 5% — фенилполисилоксан, 95% — диметилполисилоксан (толщина пленки сорбента 0,25 мкм).

Температура детектора: квадруполь — 150 °C, источник — 230 °C; переходной камеры — 280 °C.

Температура испарителя: 280 °C.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура — 190 °C, выдержка 2 мин, нагрев колонки со скоростью 5 градусов в минуту до температуры 230 °C, выдержка 3 мин, нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 270 °C.

Газ 1 (гелий): поток в колонке 1,0 см3/мин.

Давление — 106,9 кПа.

Средняя линейная скорость — 39 см/с.

Хроматографируемый объем: 1 мм3.

Режим сканирования — SIM, m/z: 91, 223, 294, 321.

Линейный диапазон детектирования: 0,005 — 0,05 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор цифлуфенамида с концентрацией 0,05 мкг/см3, разбавляют смесью гексан-ацетон (2:8, по объему), не более чем в 50 раз.

10. Обработка результатов анализа

Содержание цифлуфенамида в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

X = \frac{A \cdot V}{m} \times 10,

где X — содержание цифлуфенамида в пробе, мг/кг;

A — концентрация цифлуфенамида, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см3;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;

m — масса анализируемого образца, г;

10 — коэффициент, учитывающий долю экстракта, отобранного для пробоподготовки.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r, (1)

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8\sigma_{r} .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta) мг/кг при вероятности P = 0,95,

где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot \text{Х}}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание цифлуфенамида в пробе менее 0,01 мг/кг» <*>.

<*> 0,01 мг/кг — предел обнаружения цифлуфенамида в винограде и виноградном соке.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание цифлуфенамида в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,005 до 0,05 мкг/см3.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

A = \frac{|X - C| \cdot 100}{C} \leq B, (2)

где X — концентрация цифлуфенамида в пробе при контрольном измерении, мкг/см3;

C — известная концентрация градуировочного раствора цифлуфенамида, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;

B — норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов цифлуфенамида, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.3.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

\text{С}_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},\text{Х}} + \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime},

где \pm \Delta_{\text{л},\text{Х}}( \pm \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,

где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:

\text{К}_{\text{к}} = \overline{\text{Х}}\prime - \overline{\text{Х}} - \text{С}_{\text{д}},

где \overline{\text{Х}}\prime , \overline{\text{Х}} , Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}} .

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Кк| <= К, (3)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R, (4)

где X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.