МУК 4.1.3197-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания протиоконазола по метаболиту протиоконазол-дестио в зерне, масле и зеленой массе сои, репке и зеленой массе лука, семенах, масле и зеленой массе подсолнечника методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 29.07.2014)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 июля 2014 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ИЗМЕРЕНИЕ ОСТАТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ ПРОТИОКОНАЗОЛА ПО МЕТАБОЛИТУ ПРОТИОКОНАЗОЛ-ДЕСТИО В ЗЕРНЕ, МАСЛЕ И ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ СОИ, РЕПКЕ И ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ ЛУКА, СЕМЕНАХ, МАСЛЕ И ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3197-14
1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ фитопатологии (Л.В. Дубовая, А.М. Макеев).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 26 июня 2014 г. № 1).
3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 июля 2014 г.
Свидетельство о метрологической аттестации от 03.10.2013 № 01.00225/205-27-13
1. Назначение и область применения
Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций протиоконазола по метаболиту протиоконазол-дестио в зеленой массе сои и подсолнечника в диапазоне 0,05 — 0,50 мг/кг, в зерне и масле сои, семенах и масле подсолнечника в диапазоне 0,025 — 0,250 мг/кг, в репке и зеленой массе лука в диапазоне 0,02 — 0,20 мг/кг.
Методические указания носят рекомендательный характер.
2-[(2RS)-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-2H-1,2,4-триазол-3(4H)-тион.
Эмпирическая формула: C14HI5Cl2N3OS.
Бесцветное или светло-бежевое твердое вещество без запаха. Температура плавления: 139,1 — 144,5 °C. Давление паров при 20 °C: << 4 x 10-7 Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода: Kow log P = 4,16 (pH 4), 3,82 (pH 7) и 2,0 (pH 9). Растворимость (г/дм3) при 20 °C: ацетон — > 250, этилацетат — > 250, дихлорметан — 88, ацетонитрил — 69; растворимость в воде — 0,005 (pH 4), 0,3 (pH 8) и 2,0 (pH 9).
Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой (DT50 = 120 дней) и щелочной (DT50 >= 1 года) средах.
В присутствии света в водных фотолитических условиях протиоконазол достаточно быстро деградирует с периодом полураспада 47,7 ч.
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс — > 6 200 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для крыс — > 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC50) для крыс — > 4 990 мг/м3 воздуха.
Протиоконазол не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз, не обладает эмбриотоксическим или тератогенным действием. LC50 для рыб — 1,83 мг/дм3 (96 ч).
Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей, дафний и почвенных микроорганизмов.
Основной метаболит протиоконазола
Протиоконазол-дестио (SXX 0665)
\alpha - (1 - \text{хлорциклопропил}) - \alpha - (2 - \text{хлорфенил})\text{метил} - 1\text{Н} - 1,2,4 - \text{триазол} - 1 - \text{этанол} .
Эмпирическая формула: Cl4Hl5Cl2N3O.
Бесцветный порошок без запаха. Температура плавления: 108,5 °C. Давление паров при 20 °C: 2,7 x 10-7 Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода: Kow log P = 3,04. Растворимость (г/дм3) при 20 °C: гексан — 3, толуол — 84, ацетон — 100, ацетонитрил — 43, дихлорметан — более 200, вода — 0,051.
Метаболит стабилен в кислой и щелочной средах (DT50 >= 500 ч).
Протиоконазол — фунгицид системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество обладает защитным, искореняющим и лечебным действием.
Применяется в России в качестве фунгицида системного действия в составе смесевых препаратов для протравливания зерна колосовых культур и обработки вегетирующих растений зерновых злаков и рапса с нормой расхода 37 — 50 г д.в./т семян или 80 — 100 г д.в./га.
Проходит регистрационные испытания в Российской Федерации в качестве фунгицида в составе смесевых препаратов для протравливания зерна гороха и проса и семян льна с нормой расхода до 82,5 г д.в./т, а также для однократной обработки посевов кукурузы при норме расхода до 125 г д.в./га.
Протиоконазол весьма лабильное вещество и при поступлении в растение очень быстро метаболизируется до более устойчивого соединения — протиоконазол-дестио ( \alpha - (1 - \text{хлорциклопропил}) - \alpha - (2 - \text{хлорфенил})\text{метил} - 1\text{Н} - 1,2,4 - \text{триазол} - 1 - \text{этанол} ). В связи с этим разработан метод, позволяющий осуществлять контроль за содержанием остаточных количеств протиоконазола в зеленой массе растений, зерне и масле сои, семенах и масле подсолнечника, репке лука по протиоконазол-дестио.
2. Метрологические характеристики
При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющие) результатов измерений не превышает значений, приведенных в таблице.
3. Метод измерений
Метод основан на экстракции метаболита протиоконазол-дестио из зеленой массы растений водным раствором ацетона, из зерна и семян водным раствором ацетонитрила, из масла ацетонитрилом, очистке экстрактов от коэкстрактивных компонентов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия, с последующим измерением содержания протиоконазол-дестио в очищенных экстрактах методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) при программировании температуры колонки с термоионным детектором (ТИД) и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.
4. Требования к средствам измерений, вспомогательным устройствам, реактивам и материалам
4.1. Средства измерений
| Газовый хроматограф с термоионным детектором | |
|---|---|
| Весы аналитические с пределом взвешивания до 110 г и допустимой погрешностью 0,0001 г | ГОСТ Р 53228-2008 |
| Весы лабораторные с пределом взвешивания до 160 г и допустимой погрешностью 0,005 г | ГОСТ Р 53228-2008 |
| Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770-74 |
| Пипетки градуированные 1-1-2-1; 1-1-2-2; 1-2-2-5; 1-2-2-10 | ГОСТ 29227-91 |
| Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой П-2-5-0,1; П-2-10-0,2 | ГОСТ 1770-74 |
| Цилиндры мерные 1-25; 1-50; 1-100; 1-500; 1-1000 | ГОСТ 1770-74 |
| Микрошприц для ввода образцов для газового хроматографа вместимостью 1 — 10 см3 | ТУ 64-1-2850 |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
4.2. Реактивы
| Протиоконазол-дестио, аналитический стандарт с содержанием основного вещества 98,5% | |
|---|---|
| Ацетон, особо чистый | ГОСТ 2603-79 |
| Ацетонитрил для хроматографии, химически чистый | ТУ 6-09-3534-87 |
| Вода для лабораторного анализа (деионизованная, бидистиллированная) | ГОСТ Р 52501-2005 |
| Гелий газообразный, очищенный (или азот) | ТУ-0271-135-31323949-2005 |
| н-Гексан, химически чистый | ТУ 6-09-3375-78 |
| Калий марганцово-кислый (калия перманганат), химически чистый | ГОСТ 20490-75 |
| Калий углекислый (калия карбонат), химически чистый | ГОСТ 4221-76 |
| Кальций хлористый (кальция хлорид), химически чистый | ГОСТ 4161-77 |
| Кислота серная концентрированная, химически чистая | ГОСТ 4204-77 |
| Метилен хлористый (дихлорметан), химически чистый | ГОСТ 12794-80 |
| Натрий углекислый, химически чистый | ГОСТ 83-79 |
| Натрий серно-кислый, безводный, химически чистый | ГОСТ 4166-76 |
| Натрий хлористый, химически чистый | ГОСТ 4233-77 |
| Фосфор (V) оксид (пентоксид фосфора) | ТУ 6-09-4173-85 |
| Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), химически чистый | ГОСТ 1138-84 |
Примечание. Допускается использование других реактивов с более высокой квалификацией.
4.3. Вспомогательные устройства, материалы
| Аппарат для встряхивания проб | ТУ 64-1-2851-78 |
|---|---|
| Ванна ультразвуковая с рабочей частотой 35 кГц | |
| Вата медицинская гигроскопическая хлопковая, нестерильная | ГОСТ 5556-81 |
| Генератор водорода | |
| Гомогенизатор с металлическим стаканом вместимостью не менее 500 см3 и скоростью вращения ножа не менее 10 000 об./мин | |
| Компрессор | |
| Воронка Бюхнера | ГОСТ 9147-80 |
| Воронки делительные вместимостью 100 и 250 см3 | ГОСТ 25336-82 |
| Воронки лабораторные стеклянные | ГОСТ 25336-82 |
| Колба Бунзена вместимостью 250 см3 | ГОСТ 25336-82 |
| Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 50, 100 см3 | ГОСТ 9737-93 |
| Колбы плоскодонные вместимостью 250 см3 | ГОСТ 9737-93 |
| Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с нанесенной пленкой из смеси 5% дифенилполисилоксана и 95% диметилполисилоксана, толщиной 0,5 мкм | |
| Колонка хроматографическая стеклянная длиной 25 см и внутренним диаметром 8 — 10 мм | |
| Мельница электрическая лабораторная | ТУ 46-22-236-79 |
| Оксид алюминия нейтральный для колоночной хроматографии с размером частиц 0,063 — 0,200 мм | |
| Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар | |
| Стаканы химические вместимостью 100 и 250 см3 | ГОСТ 25336-82 |
| Стекловата | |
| Установка для перегонки растворителей с дефлегматором | ГОСТ 9737-93 (ИСО 641-75) |
| Фильтры бумажные средней плотности | ТУ 6-09-1678-86 |
| Шприц медицинский инъекционный однократного применения вместимостью 10 см3 | ГОСТ Р ИСО 7886-1-09 |
Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
5. Требования безопасности, охраны окружающей среды
5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88.
5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Обучение работающих правилам безопасности труда проводят согласно ГОСТ 12.0.004-90.
5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019-2009 и инструкцией по эксплуатации прибора.
5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.
6. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, прошедший обучение, имеющий опыт работы в лаборатории и владеющий техникой проведения газохроматографического анализа, освоивший данную методику и подтвердивший соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
7. Требования к условиям измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия.
7.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу
| Температура воздуха | (20 +/- 5) °C |
|---|---|
| Атмосферное давление | (84 — 106) кПа |
| Относительная влажность воздуха | не более 80% |
7.2. Условия хроматографического анализа
8. Подготовка к выполнению измерений
Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, раствора внесения, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей, подготовка колонки с оксидом алюминия, проверка хроматографического поведения протиоконазол-дестио на колонке.
8.1. Очистка органических растворителей
8.1.1 Ацетон
Ацетон перегоняют над перманганатом калия и карбонатом калия (на 1 дм3 ацетона — 10 г перманганата калия и 2 г карбоната калия). Срок хранения — 1 неделя.
8.1.2 Ацетонитрил
Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм3 ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм3 ацетонитрила — 10 г карбоната калия). Срок хранения — 1 неделя.
Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над карбонатом калия. Срок хранения — 1 неделя.
8.1.4 Хлористый метилен и этилацетат
Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%
Навеску (5,0 +/- 0,1) г натрия углекислого растворяют в конической колбе в (40 — 60) см3 деионизованной воды. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем раствора до метки деионизованной водой. Срок хранения раствора — 1 неделя.
Хлористый метилен и этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором кальция хлористого, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют. Срок хранения — 1 неделя.
8.2. Кондиционирование хроматографической колонки
Капиллярную кварцевую колонку устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 290 °C и скорости газа-носителя 2 см3/мин в течение 8 — 10 ч.
8.3. Приготовление градуировочных растворов
8.3.1 Исходный градуировочный раствор протиоконазол-дестио (100 мкг/см3)
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,010 +/- 0,0001) г протиоконазол-дестио, растворяют в 40 — 50 см3 этилацетата, доводят объем раствора этим же растворителем до метки, тщательно перемешивают.
Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше минус 18 °C в течение не более 3 месяцев.
8.3.2 Градуировочный раствор протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 10 мкг/см3 (раствор № 1)
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10 см3 исходного градуировочного раствора протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 100 мкг/см3 (п. 8.3.1), доводят объем раствора до метки этилацетатом, тщательно перемешивают. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов № 2 — 5.
Для приготовления проб зерна, семян, масла и зеленой массы с внесением при оценке полноты извлечения протиоконазол-дестио из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор протиоконазол-дестио с концентрацией 1 мкг/см3.
Градуировочный раствор № 1 и ацетоновый раствор протиоконазол-дестио хранят при температуре не выше минус 18 °C в течение месяца.
8.3.3. Градуировочные растворы протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 0,1 — 1,0 мкг/см3 (растворы № 2 — 5)
В 4 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см3 градуировочного раствора № 1 протиоконазол-дестио с массовой концентрацией 10 мкг/см3 (п. 8.3.2), доводят до метки смесью гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 9:1, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией протиоконазол-дестио 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см3 соответственно.
Растворы готовят непосредственно перед использованием.
8.4. Градуировка хроматографа
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мкВ) от концентрации протиоконазол-дестио в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной градуировки по четырем градуировочным растворам.
В инжектор хроматографа вводят по 1 мм3 каждого градуировочного раствора (п. 8.3.3) и анализируют при условиях хроматографирования по п. 7.2. Осуществляют не менее трех параллельных измерений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r.
По полученным данным строят градуировочную характеристику.
8.5. Контроль стабильности градуировочной характеристики
Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.
Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.
Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие (1)
\frac{|S_{\text{изм}.} - S_{\text{гр}.}|}{S_{\text{гр}.}} \cdot 100 \leq K_{\text{гр}.}, (1)
где Sизм., Sгр. — значение площади пика протиоконазол-дестио в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно, мкВ;
Kгр. — норматив контроля, K_{\text{гр}.} = 0,5 \cdot \delta , где \pm \delta — границы относительной погрешности, % (табл.).
Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.
Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.
8.6. Подготовка колонки с оксидом алюминия
Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 — 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г оксида алюминия нейтрального III степени активности в 15 см3 гексана (оксид алюминия III степени активности по Брокману получают добавлением 6% воды к навеске оксида алюминия I степени активности). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 см3 гексана со скоростью 1 — 2 капли/с, после чего она готова к работе.
8.7. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания протиоконазол-дестио из колонки с оксидом алюминия
В круглодонную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,2 см3 градуировочного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 10 мкг/см3 в этилацетате (п. 8.3.2). Растворитель упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C, остаток растворяют в 2 см3 смеси гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 85:15, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с оксидом алюминия, подготовленную по п. 8.6. Колбу обмывают 2 см3 смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 20 см3 смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 — 2 капли/с, элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 40 см3 смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему), отбирая последовательно по 5 см3 элюата. Каждую фракцию упаривают досуха, остатки растворяют в 1 см3 смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и затем хроматографируют в соответствии с п. 7.2.
По результатам обнаружения протиоконазол-дестио в каждой из фракций определяют объем смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему), необходимый для полного вымывания вещества из колонки.
Примечание. Профиль вымывания протиоконазол-дестио может меняться при использовании новых партий сорбента и растворителей.
9. Отбор и хранение проб
Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ Р 52062-2003 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ 1723-86 «Лук репчатый свежий заготовляемый и поставляемый. Технические условия», ГОСТ Р 51783-2001 «Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. Технические условия», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).
Пробы зеленой массы и репки хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5 дней; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C до анализа. Пробы зерна и семян высушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу. Пробы масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °C. В некоторых случаях масло получают из семян масличных культур экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.
10. Проведение определения
10.1. Экстракция протиоконазол-дестио
10.1.1. Зеленая масса сои и подсолнечника, репка и зеленая масса лука. Измельченный образец массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см3, добавляют 100 см3 смеси ацетон-вода в объемном соотношении 8:2 и гомогенизируют 3 мин при 10 000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 см3. Осадок на фильтре промывают 50 см3 смеси ацетон-вода (8:2, по объему). Аликвоту объединенного фильтрата, эквивалентную 5 г образца, переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см3 и упаривают до водного остатка (3 — 5 см3) на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. К водному остатку добавляют 25 см3 деионизованной воды и далее проводят очистку экстракта по п. 10.2.
10.1.2. Зерно сои, семена подсолнечника. Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 см3, вносят 50 см3 смеси ацетонитрил-вода в объемном соотношении 9:1 и помещают на аппарат для встряхивания на 40 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 см3. Осадок на фильтре промывают 25 см3 смеси ацетонитрил-вода (9:1, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 см3. В воронку вносят 10 см3 гексана, насыщенного ацетонитрилом, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После расслоения фаз гексановый слой отбрасывают, а водно-ацетонитрильную фракцию переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см3 и упаривают до водного остатка (1 — 2 см3) на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. К водному остатку добавляют 30 см3 деионизованной воды и далее проводят очистку экстракта по п. 10.2.
10.1.3. Масло. К образцу масла массой 5 г, помещенного в плоскодонную колбу вместимостью 250 см3, приливают 15 см3 гексана и перемешивают. К раствору добавляют 50 см3 ацетонитрила и колбу помещают на встряхиватель на 30 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 см3 через слой ваты, помещенной в конусную воронку. Операцию экстракции масла повторяют, используя 30 см3 ацетонитрила. После декантации ацетонитрильного слоя вату промывают 10 см3 ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Объединенную ацетонитрильную фазу переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 15 см3 гексана, насыщенного ацетонитрилом, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После расслоения фаз гексановый слой отбрасывают, а ацетонитрильную фракцию упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Далее проводят очистку экстракта по п. 10.3.
10.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
К водным экстрактам зеленой массы, зерна и семян, полученным по пп. 10.1.1 и 10.1.2 и находящимся в делительных воронках, приливают 30 см3 хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см3. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 см3 хлористого метилена. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C и остаток подвергают дополнительной очистке на колонке с оксидом алюминия по п. 10.3.
10.3. Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия
Остаток в круглодонной колбе, полученный по пп. 10.1.3 и 10.2, растворяют в 2 см3 смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 85:15, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин.
Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 8.6. Колбу обмывают 2 см3 смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), которые также наносят на колонку.
Промывают колонку 20 см3 смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 — 2 капли/с, элюат отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют с колонки 25 см3 смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 7:3, собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 см3. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Остаток экстракта зеленой массы сои и подсолнечника растворяют в 2,5 см3, зерна сои и семян подсолнечника в 1,25 см3, репки и зеленой массы лука в 1 см3 смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 9:1, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и растворы анализируют на содержание протиоконазол-дестио по п. 11.1.
Полнота извлечения протиоконазол-дестио при проведении всех операций подготовки пробы не менее 86%.
11. Выполнение измерений
11.1. В испаритель хроматографа вводят 1 мм3 очищенного экстракта анализируемой пробы (пп. 10.1 - 10.3), анализируют при условиях п. 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.
11.2. Для каждого образца зеленой массы, репки, зерна и семян повторяют операции по пп. 10.1 - 10.3, 11.1, для масла — по пп. 10.1, 10.3, 11.1.
12. Обработка результатов измерений
12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации.
Альтернативная обработка результатов
Массовую долю протиоконазол-дестио X (мг/кг) в образцах зеленой массы, репки, зерна, семян и масла рассчитывают по формуле (2).
X = \frac{S_{1} \cdot A \cdot V}{0,86 \cdot S_{0} \cdot m} , (2)
где S1 — площадь пика протиоконазол-дестио в образце, мкВ;
S0 — площадь пика протиоконазол-дестио в градуировочном растворе, мкВ;
A — массовая концентрация градуировочного раствора протиоконазол-дестио, мкг/см3;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с оксидом алюминия и последующего хроматографического определения, г;
0,86 — коэффициент извлечения протиоконазол-дестио, учитывающий все процедуры подготовки пробы.
При расчете содержания протиоконазол-дестио в эквивалентах протиоконазола полученное значение X умножают на 1,1.
12.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (3)
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq r, (3)
где X1, X2 - результаты параллельных определений массовой доли протиоконазол-дестио, мг/кг;
r — значение предела повторяемости, % (табл.).
Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями данной методики.
12.3 Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде
\overline{X} \pm 0,01 \cdot \delta \cdot \overline{X} , при P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\pm \delta — границы относительной погрешности измерений, % (табл.).
В случае, если полученный результат измерений ниже нижней границы диапазона измерений, результат анализа представляют в виде:
«массовая доля протиоконазол-дестио в зеленой массе сои и подсолнечника менее 0,05 мг/кг»;
«массовая доля протиоконазол-дестио в зерне и масле сои и подсолнечника менее 0,025 мг/кг»;
«массовая доля протиоконазол-дестио в репке и зеленой массе лука менее 0,02 мг/кг».
Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал протиоконазол-дестио, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют смесью гексан-этилацетат с объемным соотношением компонентов 9:1 и анализируют в соответствии с данной методикой.
13. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости
13.1 Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:
а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;
б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).
13.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.
13.3. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости R.
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq R, (4)
где X1, X2 - результаты измерений массовой доли протиоконазол-дестио, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;
R — значение предела воспроизводимости, % (табл.).
Если предел воспроизводимости не превышен, то приемлемы все результаты измерений и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если предел воспроизводимости превышен, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.3).
При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.4).
14. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории
Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений», используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.
Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.
При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.