МУК 4.1.3186-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств диметоморфа в салате методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 24.07.2014)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 24 июля 2014 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИМЕТОМОРФА В САЛАТЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3186-14

Разработаны сотрудниками «Всероссийского НИИ защиты растений», С.-Петербург (Долженко В.И., Цибульская И.А., Черменская Т.Д., Комарова А.С.).

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.163/01.00043/2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации диметоморфа в салате в диапазоне концентраций 0,1 — 1,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: диметоморф.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (E,Z)-4-[3-(4-хлорофенил)-3-(3,4-диметоксифенил) акрилоил]морфолин.

(E,Z)-4-[3-(4-хлорофенил)-3-(3,4-диметоксифенил)-1-оксо-2-пропенил]морфолин (CAS).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₂₁H₂₂ClNO₄.

Молекулярная масса: 387,9.

Смесь изомеров представляет собой бесцветные кристаллы с температурой плавления 125,2 — 149,2 °C. (E)-изомер имеет температуру плавления 136,8 — 138,3 °C, давление пара 9,7 x 10-4 мПа (25 °C). (Z)-изомер имеет температуру плавления 166,3 — 168,5 °C, давление пара 1,0 x 103 мПа (25 °C).

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода Kow lgP = 2,63 для (E)-изомера; 2,73 для (Z)-изомера (20 °C). Растворимость в воде 81,1 (pH 5), 49,2 (pH 7), 41,8 (pH 9) (мг/дм3, 20 °C).

Растворимость в органических растворителях (мг/дм3, ₂₀ °C): н-гексан — 0,11; толуол — 49,5; дихлорметан — 461; метанол — 39; ацетон — 100; этилацетат — 48,3.

Гидролитически и термически стабилен в нормальных условиях. (E)- и (Z)-изомер переходят друг в друга на свету.

Краткая токсикологическая характеристика. LD50 для крыс — 3 500 — 4 300, мышей — 3 700 — 5 000 мг/кг. Острая кожная активность для крыс LD50 > 5 000 мг/кг. Не ирритант для кожи и глаз (кролики). Ингаляционная активность LC50 > 4,2 мг/дм3. LD50 для пчел > 100 мкг/особь.

Область применения. Локальный системный фунгицид, ингибитор образования клеточной стенки грибного оомицета, ингибитор роста и спороношения грибов.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения диметоморфа, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на определении диметоморфа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора (УФ) после его извлечения из образцов ацетонитрилом и последующей очистки методом твердофазной экстракции (ТФЭ).

Идентификация диметоморфа проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2 Кондиционирование патрона для ТФЭ

Патроны для ТФЭ на основе силикагеля с привитыми аминогруппами (0,4 г) промывают 2 см3 смеси № 2, затем 3 см3 смеси № 1.

7.3 Приготовление растворов

7.3.1. Раствор ортофосфорной кислоты 0,005 М. В мерную колбу объемом 1 дм3 помещают (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65 по объему, используя мерные цилиндры.

7.4 Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3. Точную навеску диметоморфа (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2 Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями диметоморфа 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65).

7.4.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,05 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение недели.

При изучении полноты определения диметоморфа в салате используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5 Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация диметоморфа в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации диметоморфа в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

C = KS,

где S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|\text{С } - \text{С}_{\text{К}}|}{\text{С}} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.},

где C — аттестованное значение массовой концентрации диметоморфа в градуировочном растворе;

CK — результат контрольного измерения массовой концентрации диметоморфа в градуировочном растворе;

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).

7.6 Проверка хроматографического поведения диметоморфа

на патроне для ТФЭ

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора диметоморфа с концентрацией 1 мкг/см3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см3 смеси № 1 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см3 смеси № 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 3 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют диметоморф смесью № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы (ацетонитрил — 0,005 М ортофосфорная кислота, 35:65) и анализируют по п. 9.3.

Фракции, содержащие диметоморф, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения диметоморфа следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79). Для длительного хранения пробы салата помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C в герметичной полиэтиленовой упаковке.

9. Проведение определения

9.1 Экстракция диметоморфа из салата

Навеску измельченного салата 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, последовательно добавляют 10 см3 ацетонитрила, 8 г семиводного магния серно-кислого и 1 г хлористого натрия. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 5 мин при скорости 4 000 об/мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают аликвоту 5 см3, переносят в круглодонную колбу вместимостью 25 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке по п. 9.2.

9.2 Очистка на патроне для ТФЭ

Сухой остаток, полученный по п. 9.1, растворяют в 1 см3 смеси № 1, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см3 смеси № 1 и также наносят на патрон. Патрон промывают 3 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Диметоморф элюируют 5 см3 смеси № 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в 10 см3 подвижной фазы и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.3 Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки: (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора: 245 нм. Объем вводимой пробы: 10 мм3.

Время удерживания E-диметоморфа (11,1 +/- 0,1) мин, Z-диметоморфа (13,2 +/- 0,1) мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание диметоморфа в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = \frac{(S_{1} + S_{2}) \cdot K \cdot V}{P} \cdot f,

где (S₁ + S₂) — сумма площадей пиков диметоморфа в анализируемой пробе, мм2 (AU);

K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P — навеска анализируемого образца, г;

f — полнота извлечения диметоморфа, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств диметоморфа в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор диметоморфа с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r, (1)

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot \text{Х}}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,1 мг/кг*, где * — 0,1 мг/кг — предел определения диметоморфа в салате).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

\text{С}_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},\text{Х}} + \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime},

где \pm \Delta_{\text{л},\text{Х}}( \pm \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг;

при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,

где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot \text{Х}}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:

Кк = X' — X - Cд,

где X', X, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}} .

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Кк| <= К, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R, (3)

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.