МУК 4.1.3185-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств прохлораза в зеленой массе, семенах и масле подсолнечника и рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 24.07.2014)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 24 июля 2014 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПРОХЛОРАЗА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА И РАПСА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3185-14

Разработаны сотрудниками «Всероссийского НИИ защиты растений», С.-Петербург (Долженко В.И., Цибульская И.А., Комарова А.С.).

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.175/01.00043/2014.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств прохлораза в зеленой массе, семенах подсолнечника и рапса в диапазоне концентраций 0,025 — 0,250 мг/кг; в масле подсолнечника и рапса 0,05 — 0,50 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: прохлораз.

Название действующего вещества по ИЮПАК: N-пропил-N-[2-(2,4,6-трихлорфенокси)этил]-имидазол-1-карбоксамид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C15H16Cl3N3O2.

Молекулярная масса: 376,7.

Химически чистое вещество, бесцветный кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 46,5 — 49,3 °C.

Давление пара при 20 °C: 9 x 10-2 мПа, KowlogP = 4,12.

Растворимость: в воде (25 °C) — 34,4 мг/л; ксилоле — 2,5; ацетоне — 3,5; гексане — 7,5 x 10-3 кг/л (25 °C). Легко растворим в хлороформе, диэтиловом эфире, толуоле. Гидролитически стабилен в диапазоне pH от 5,0 до 7,22 при 22 °C (период наблюдения 30 дней). Разлагается под действием света в присутствии сильных кислот и оснований, а также при длительном нагревании при температуре 200 °C. Слабое основание (pKa 3,8).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность ЛД₅₀ для крыс 1 600 — 2 400 мг/кг, для мышей — 2 400 мг/кг. Дермальная токсичность ЛД50 превышает 2 100 мг/кг для крыс и 3 000 мг/кг — для кроликов. Ингаляционная токсичность LC50 для крыс превышает 2,16 мг/м3 воздуха (период наблюдения 4 ч). Не оказывает раздражающего действия на кожу.

Область применения препарата. Фунгицид защитного и уничтожающего действия. Эффективен против возбудителей болезней Pseudocercosprella, Pyrenophora, Rhynchosporium, Septoria, Alternaria, Botrytis и др. в посевах зерновых, овощных, технических и плодовых культур при нормах расхода 400 — 600 г д.в./га.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения прохлораза, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на определении прохлораза методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов смесью гексан-ацетон, очистки перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и последующей очистки твердофазной экстракцией на патронах.

Идентификация прохлораза проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства и материалы

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2 Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

7.3 Подготовка концентрирующих патронов

для очистки экстракта

Кондиционирование патронов, заполненных силикагелем 60 (0,5 г), осуществляют пропусканием 2,5 см3 гексана.

7.4 Приготовление растворов

7.4.1. Раствор ортофосфорной кислоты 0,005 М. В мерную колбу объемом 1 дм3 помещают (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.4.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.

7.5 Приготовление основного и градуировочных растворов

7.5.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3. Точную навеску прохлораза (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.5.2 Приготовление градуировочных растворов.

Градуировочные растворы с концентрациями прохлораза 0,25; 0,5; 1,25 и 2,5 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

7.5.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 2,5 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,5 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.5.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 1,25 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 5,0 см3 раствора № 1 и доводят до метки подвижной фазой.

7.5.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,5 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.5.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,25 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике в силанизированном или тефлоновом флаконе при температуре 0 — 4 °C в течение месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.

При изучении полноты извлечения прохлораза используют ацетонитрильные растворы вещества.

7.6 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация прохлораза в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации прохлораза в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

C = KS, где

S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|\text{С } - \text{С}_{\text{К}}|}{\text{С}} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.} , где

C — аттестованное значение массовой концентрации прохлораза в градуировочном растворе;

CК — результат контрольного измерения массовой концентрации прохлораза в градуировочном растворе;

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10% при P = 0,95).

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79), а также отбор проб семян подсолнечника и рапса для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 0852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».

Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

9. Проведение определения

9.1 Определение прохлораза в зеленой массе,

семенах подсолнечника и рапса

В коническую колбу вместимостью 100 см3 помещают (10 +/- 0,1) г измельченных семян подсолнечника (рапса) или зеленой массы, прибавляют 30 см3 смеси гексан-ацетон в соотношении 70:30 и экстрагируют в ультразвуковой бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр быстрой фильтрации. Экстракцию повторяют дважды. Объединенный экстракт помещают в делительную воронку и отделяют нижний слой. Органический слой упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 10 см3 гексана и вносят в предварительно кондиционированный по п. 7.3 патрон. Патрон последовательно промывают 10 см3 гексана и 2,5 см3 элюента 1. Фильтрат и промывку отбрасывают. Прохлораз элюируют 6 см3 элюента 2. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C). Сухой остаток растворяют в 2 см3 гексана и вносят в такой же предварительно кондиционированный патрон. Промывают 5 см3 элюента 1. Фильтрат и промывку отбрасывают. Прохлораз элюируют 5 см3 элюента 2. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C). Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 образца вводят в жидкостный хроматограф.

9.2 Определение прохлораза в масле подсолнечника и рапса

Масло в количестве (5 +/- 0,05) г растворяют в 25 см3 гексана и пропускают через патрон, кондиционированный по п. 7.3. Промывают последовательно 25 см3 гексана и 2,5 см3 элюента 1. Фильтрат и промывку отбрасывают. Прохлораз элюируют 6 см3 элюента 2. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C). Остаток растворяют в 2 см3 гексана и вносят в аналогичный, кондиционированный по п. 7.3 патрон. Фильтрат отбрасывают, а прохлораз элюируют 10 см3 элюата 2. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C). Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 полученного раствора вводят в хроматограф.

9.3 Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки: (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,15 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора: 230 нм. Объем вводимой пробы: 10 мм3. Абсолютное время удерживания прохлораза составляет (3,5 +/- 0,1) мин.

10. Обработка результатов анализа

Содержание прохлораза в образцах зеленой массы, семенах и масле подсолнечника и рапса (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = \frac{S_{2} \cdot C \cdot V}{S_{1} \cdot P} , где

S₁ - площадь пика прохлораза в стандартном растворе (мВ·с);

S2 — площадь пика прохлораза в анализируемой пробе (мВ·с);

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P — навеска анализируемого образца, г;

C — концентрация стандартного раствора прохлораза, мкг/см3.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор прохлораза 1 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(X \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где

X — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot \text{Х}}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,025 мг/кг <>, где <> — 0,025 мг/кг — предел обнаружения прохлораза в семенах подсолнечника).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

3.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

\text{С}_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},\text{Х}} + \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime} , где

\pm \Delta_{\text{л},\text{Х}}( \pm \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг;

при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot \text{Х}}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:

Кк = X' — X - Cд, где

X', X, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}}

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Кк| <= К, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |\text{Х}_{1} - \text{Х}_{2}| \cdot 100}{(\text{Х}_{1} + \text{Х}_{2})} \leq R , где (3)

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.