--- title: "\"МУК 4.1.3063-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания клотианидина в зеленой массе, зерне и масле кукурузы, семенах, масле и зеленой массе подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания\"" number: "МУК 4.1.3063-13" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/muk-4-1-3063-13" --- ## "МУК 4.1.3063-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания клотианидина в зеленой массе, зерне и масле кукурузы, семенах, масле и зеленой массе подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания" # "МУК 4.1.3063-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания клотианидина в зеленой массе, зерне и масле кукурузы, семенах, масле и зеленой массе подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания" (утв. Роспотребнадзором 14.07.2013) > [!IMPORTANT] > Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 N 299).
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
14 июля 2013 года #### 4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ **ИЗМЕРЕНИЕ ОСТАТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ КЛОТИАНИДИНА** **В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ЗЕРНЕ И МАСЛЕ КУКУРУЗЫ, СЕМЕНАХ,** **МАСЛЕ И ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ** **ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **МУК 4.1.3063-13** 1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийский НИИ фитопатологии. 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1). 3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 14 июля 2013 г. 4. Введены впервые. Свидетельство о метрологической аттестации от 14.12.2012 N 01.00225/205-78-12. ## 1. Назначение и область применения Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций клотианидина в зерне и масле кукурузы, семенах и масле подсолнечника в диапазоне 0,02 - 0,20 мг/кг, в зеленой массе кукурузы и подсолнечника в диапазоне 0,05 - 0,50 мг/кг. Методические указания носят рекомендательный характер. Название действующего вещества по ИСО: клотианидин. Название действующего вещества по ИЮПАК: (E)-1-(2-хлор-1,3-тиазол-5-илметил)-3-метил-2-нитрогуанидин. Структурная формула: ![1. Назначение и область применения](https://i.bukva.ai/xk7efPJJ/img_0.png) Эмпирическая формула: C H ClN O S. 6 8 5 2 Молекулярная масса: 249,7. Бесцветный порошок без запаха. Температура плавления: 176,8 °C. -7 Давление паров при 25 °C: 1,3 x 10 мПа. Коэффициент распределения в системе н-октанол/вода: K log P = 0,7 (при 25 °C). Растворимость (г/куб. ow дм) при 20 °C: ацетон - 15,2; метанол - 6,26; этилацетат - 2,03; дихлорметан - 1,32; гептан - 0,001; вода - 0,327. В почве в аэробных условиях клотианидин разрушается очень медленно: DT = 148 - 1155 дней. 50 Краткая токсикологическая характеристика Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс > 5000 мг/кг; острая 50 дермальная токсичность (LD ) для крыс > 2000 мг/кг; острая ингаляционная 50 токсичность (LC ) для крыс > 6141 мг/куб. м воздуха. Клотианидин не 50 оказывает раздражающего действия на кожу кролика. LC для рыб > 100 мг/ 50 куб. дм (96 ч). Инсектицид нетоксичен для птиц, дафний, земляных червей, почвенных микроорганизмов и опасен для пчел при прямом контакте. Область применения Клотианидин - инсектицид нервно-паралитического действия, обладает широким спектром активности против сосущих, грызущих и почвенных насекомых на овощных культурах, фруктовых и цитрусовых деревьях, рисе, кукурузе, подсолнечнике и рапсе. Вещество обладает системной активностью и может использоваться как в качестве протравителя, так и для обработки почвы и надземных органов растений. Предлагается в России в качестве составного компонента комбинированных протравителей для предпосевной обработки семян рапса и сахарной свеклы при норме расхода 5 - 10 кг д.в./т семян, а также для обработки вегетирующих растений картофеля с нормой расхода до 12,5 г д.в./га. ## 2. Метрологические характеристики При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в таблице. Таблица Анали- Диапазон Показатель Показатель Показатель Предел зируе- измерений точности повторяемости воспроизводи- повторяе- мый массовой (границы (относитель- мости (относи- мости, r, объект доли кло- относитель- ное средне- тельное сред- %, тианидина, ной погреш- квадратичес- неквадратичес- P = 0,95, мг/кг ности) кое отклонение кое отклонение n = 2 $±\delta$ , % при повторяемос- воспроизводимо P = 0,95 ти), $\sigma_{r}$ , % сти), $\sigma_{R}$ , % Зерно От 0,020 до 33 5 9 14 кукуру- 0,10 вкл. зы ────────────────────────────────────────────────────────────────── Св. 0,10 до 20 3 4,5 8 0,20 вкл. Семена От 0,020 до 34 7 11 19 подсол- 0,10 вкл. нечника ────────────────────────────────────────────────────────────────── Св. 0,10 до 18 4 6 11 0,20 вкл. Масло От 0,020 до 35 9 14 25 кукуру- 0,10 вкл. зы ────────────────────────────────────────────────────────────────── Св. 0,10 до 19 5 8 14 0,20 вкл. Масло От 0,020 до 32 8 12 22 подсол- 0,10 вкл. нечника ────────────────────────────────────────────────────────────────── Св. 0,10 до 20 4 6 11 0,20 вкл. Зеленая От 0,05 до 22 6 9 17 масса 0,10 вкл. кукуру- ────────────────────────────────────────────────────────────────── зы Св. 0,10 до 13 3 4,5 8 0,50 вкл. Зеленая От 0,05 до 24 6 9 17 масса 0,10 вкл. подсол- ────────────────────────────────────────────────────────────────── нечника Св. 0,10 до 15 4 6 11 0,50 вкл. ## 3. Метод измерений Метод основан на экстракции клотианидина из зерна и зеленой массы кукурузы, семян и зеленой массы подсолнечника водным раствором ацетона, из масла кукурузы и подсолнечника водным раствором метанола, очистке экстрактов, содержащих клотианидин, от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с флоризилом, с последующим измерением содержания клотианидина в очищенных экстрактах на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектированием и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки. ## 4. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы ### 4.1. Средства измерений Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны, снабженный дегазатором и термостатом колонки Весы аналитические с пределом взвешивания до 110 г и допустимой погрешностью 0,0001 г ГОСТ Р 53228-08 Весы лабораторные с пределом взвешивания 160 г и допустимой погрешностью 0,005 г ГОСТ Р 53228-08 Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-1000-2 [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) Пипетки градуированные 1-1-2-1; 1-1-2-2; 1-2-2-5; 1-2-2-10 [ГОСТ 29227-91](https://bukva.ai/docs/gost-29227-91) Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой П-2-5-0,1; П-2-10-0,2 [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) Цилиндры мерные 1-25; 1-50; 1-100; 1-500; 1-1000 [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 20 - 100 куб. мм *Примечание.* Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками. ### 4.2. Реактивы Клотианидин с содержанием основного вещества не менее 99,4%, аналитический стандарт Ацетон, чистый для анализа ГОСТ 2603-79 Ацетонитрил для хроматографии, х.ч. ТУ 6-09-3534-87 Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная) [ГОСТ Р 52501-05](https://bukva.ai/docs/gost-r-52501-2005) н-Гексан, х.ч. ТУ 6-09-3375-78 Калий углекислый, х.ч. [ГОСТ 4221-76](https://bukva.ai/docs/standart-gost-4221-76) Метилен хлористый (дихлорметан), х.ч. [ГОСТ 12794-80](https://bukva.ai/docs/standart-gost-12794-80) Метиловый спирт (метанол), х.ч. [ГОСТ 6995-77](https://bukva.ai/docs/standart-gost-6995-77) Натрий сернокислый, безводный, х.ч. [ГОСТ 4166-76](https://bukva.ai/docs/gost-4166-76) Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), ч. [ГОСТ 22300-76](https://bukva.ai/docs/gost-22300-76) *Примечание.* Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией. ### 4.3. Вспомогательные устройства, материалы Аппарат для встряхивания ТУ 64-1-2851-78 Ванна ультразвуковая Вата медицинская гигроскопическая хлопковая, нестерильная [ГОСТ 5556-81](https://bukva.ai/docs/gost-5556-81) Воронка Бюхнера ГОСТ 9147-80 Воронки делительные вместимостью 100 и 250 куб. см ГОСТ 25336-82 Воронки лабораторные, стеклянные ГОСТ 25336-82 Колба Бунзена вместимостью 250 куб. см ГОСТ 25336-82 Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 100 и 250 куб. см [ГОСТ 9737-93](https://bukva.ai/docs/standart-gost-9737-93) Колбы плоскодонные вместимостью 250 куб. см [ГОСТ 9737-93](https://bukva.ai/docs/standart-gost-9737-93) Колонка хроматографическая стеклянная, длиной 25 см и внутренним диаметром 10 мм Колонка аналитическая хроматографическая, стальная (150 x 4,6 мм), заполненная сорбентом с привитыми многофункциональными полярными группами С18 зернением 5 мкм Мельница лабораторная электрическая ТУ 46-22-236-84 Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 10696-75 Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М ТУ 25-11-917-76 Флоризил для колоночной хроматографии с размером частиц 60 - 100 меш. Стаканы химические вместимостью 100 и 500 куб. см ГОСТ 25336-82 Стекловата Установка для перегонки растворителей с дефлегматором [ГОСТ 9737-93](https://bukva.ai/docs/standart-gost-9737-93) (ИСО 641-75) Фильтры бумажные средней плотности ТУ 6.091678-86 Фильтры мембранные, диаметром 47 мм с размером пор 0,45 мкм *Примечание.* Допускается применение других вспомогательных средств измерений и устройств аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают вышеуказанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений. ## 5. Требования безопасности, охраны окружающей среды 5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88. 5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Обучение работающих правилам безопасности труда проводят согласно ГОСТ 12.0.004-90. 5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора. 5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. ## 6. Требования к квалификации операторов К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, прошедший обучение, имеющий опыт работы в лаборатории и владеющий техникой проведения хроматографического анализа, освоивший данную методику и подтвердивший соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений. ## 7. Требования к условиям измерений При выполнении измерений соблюдают следующие условия. ### 7.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу - температура воздуха (20 +/- 5) °C; - атмосферное давление (84 - 106) кПа; - относительная влажность воздуха не более 80%. ### 7.2. Условия хроматографического анализа Температура колонки: 27 °C. Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (20:80, в объемных соотношениях). Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин. Рабочая длина волны: 270 нм. Чувствительность: 0,001 ед. абсорбции на шкалу. Объем вводимой пробы: 5 куб. мм. Линейный диапазон детектирования 0,1 - 1 нг. ## 8. Подготовка к выполнению измерений Измерениям предшествуют следующие операции: приготовление растворов, подвижной фазы для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), градуировочных растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, приготовление колонки с флоризилом и установление объема и состава элюента, необходимого для полного вымывания клотианидина из колонки с флоризилом. ### 8.1. Приготовление раствора углекислого калия с молярной концентрацией 0,05 моль/куб. дм В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 6,9 г K CO , 2 3 приливают 100 куб. см деионизованной воды, перемешивают до растворения осадка, доводят объем водой до метки, перемешивают. Срок хранения - 1 неделя. ### 8.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 200 куб. см ацетонитрила, 800 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр. Срок хранения - 1 неделя. ### 8.3. Кондиционирование хроматографической колонки Хроматографическую колонку устанавливают в термостат хроматографа и стабилизируют при температуре 27 °C и скорости потока подвижной фазой 0,8 куб. см/мин. не менее часа до установления стабильной базовой линии (дрейф базовой линии в течение 1 ч не более 5%, а уровень шумов не более 2% от верхнего значения шкалы). ### 8.4. Приготовление градуировочных растворов ##### 8.4.1 Исходный градуировочный раствор клотианидина с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г клотианидина, растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранят при температуре не выше -18 °C. Срок хранения - не более 3 месяцев. ##### 8.4.2 Градуировочный раствор клотианидина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (раствор N 1) В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора клотианидина с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см [(п. 8.4.1)](#p100122), разбавляют ацетонитрилом до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5. Для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения клотианидина методом "внесено - найдено" используется ацетоновый раствор вещества с концентрацией 10 мкг/куб. см. Градуировочный раствор N 1 и ацетоновый раствор клотианидина хранят при температуре не выше -18 °C. Срок хранения - не более 1 месяца. 8.4.3. Градуировочные растворы клотианидина с массовой концентрацией 0,02 - 0,2 мкг/куб. см (растворы N 2 - 5) В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,2, 0,4, 1,0 и 2,0 куб. см градуировочного раствора N 1 клотианидина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см, доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по [п. 8.2](#p100116), тщательно перемешивают. Получают растворы с массовой концентрацией клотианидина 0,02, 0,04, 0,1 и 0,2 мкг/куб. см соответственно. Растворы готовят непосредственно перед использованием. ### 8.5. Градуировка хроматографа Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мкВ·с) от концентрации клотианидина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки. В инжектор хроматографа вводят по 5 куб. мм каждого градуировочного раствора [(п. 8.4.3)](#p100129) и анализируют при условиях [п. 7.2](#p100103). Осуществляют не менее трех параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r. По полученным данным строят градуировочную характеристику. ### 8.6. Контроль стабильности градуировочной характеристики Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа. Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой. Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие: |S - S | изм гр ------------ · 100 <= K , S гр гр где: S , S - значение площади пика клотианидина в образце для контроля, изм гр измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно, мкВ·с; K - норматив контроля, $K_{\text{гр}} = 0,5 \cdot \delta,$ гр где $±\delta$ - границы относительной погрешности, % [(табл. 1)](#p100029). Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку. Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново. ### 8.7. Подготовка колонки с флоризилом для очистки экстракта В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 10 мм помещают тампон из стекловаты и затем в нее всыпают 10 г сухого флоризила. Колонку промывают 30 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Через колонку пропускают 15 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего колонка готова к работе. ### 8.8. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания клотианидина из колонки с флоризилом При отработке методики или поступлении новой партии флоризила проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания клотианидина из колонки с флоризилом. В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 клотианидина с концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле [(п. 8.4.2)](#p100125), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 2 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с флоризилом, подготовленную по [п. 8.7](#p100143). Колбу обмывают 3 куб. см этилацетата, которые также вносят в колонку. Промывают колонку 50 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 50 куб. см смеси этилацетат-ацетонитрил с объемным соотношением компонентов 1:1, отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 2 куб. см подвижной фазы, подготовленной по [п. 8.2](#p100116), перемешивают и хроматографируют в соответствии с условиями [п. 7.2](#p100103). По результатам обнаружения клотианидина в каждой из фракций определяют объем смеси этилацетат-ацетонитрил с объемным соотношением 1:1, необходимый для полного вымывания клотианидина из колонки. ## 9. Отбор и хранение проб Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными [правилами](https://bukva.ai/docs/2051-79) отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79) и правилами, определенными [ГОСТ Р 50436-92](https://bukva.ai/docs/gost-r-50436-92) "Зерновые. Отбор проб зерна", [ГОСТ 13634-90](https://bukva.ai/docs/gost-13634-90) "Кукуруза. Требования при заготовке и поставке", [ГОСТ 10852-86](https://bukva.ai/docs/3979) "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 11291-93 "Масло подсолнечника. Требования при заготовках и поставках", [ГОСТ 27262-87](https://bukva.ai/docs/gost-27262-87) "Корма растительного происхождения. Методы отбора проб" и [ГОСТ 27978-88](https://bukva.ai/docs/gost-27978-88) "Корма зеленые. Технические условия". Пробы зерна кукурузы и семян подсолнечника высушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов. Пробы зеленой массы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C. Масло хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °C. В некоторых случаях масло получают из зерна кукурузы и семян подсолнечника экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа. ## 10. Проведение определения ### 10.1. Экстракция клотианидина 10.1.1. Зерно кукурузы, семена подсолнечника. Образец размолотого зерна или семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон-вода с объемным соотношением компонентов 3:1, перемешивают и колбу помещают на встряхиватель на 40 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Остаток на фильтре промывают 50 куб. см приведенной выше смеси. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть, эквивалентную 5 г образца, переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по [п. 9.2](#p100157). 10.1.2. Зеленая масса. Образец измельченного растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, приливают 125 куб. см смеси ацетон-вода с объемным соотношением компонентов 3:1 и гомогенизируют 3 мин. при 8000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см смеси ацетон-вода с объемным соотношением 3:1. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/5 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по [п. 9.2](#p100157). 10.1.3. Масло. Образец масла массой 5 г вносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, добавляют 20 куб. см гексана, перемешивают. К раствору добавляют 50 куб. см смеси метанол-вода с объемным соотношением компонентов 8:2 и воронку интенсивно встряхивают в течение двух минут. После разделения фаз декантируют водно-метанольный слой в круглодонную колбу через слой ваты, помещенной в конусную воронку. Маслянистый остаток повторно обрабатывают 50 куб. см смеси метанол-вода с объемным соотношением 8:2 и водно-метанольную фазу фильтруют через вату. Вату на фильтре промывают 10 куб. см смеси метанол-вода с объемным соотношением 8:2, фильтрат объединяют с водно-метанольными экстрактами и переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 10.2. ### 10.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей Отобранные аликвоты экстрактов растительного материала ([пп. 10.1.1](#p100154), [10.1.2](#p100155)), а также экстракт масла [(п. 10.1.3)](#p100156) упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка объемом 3 - 5 куб. см при температуре не выше 40 °C. К водному остатку приливают 20 куб. см деионизованной воды, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний органический слой собирают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, а водную фазу экстрагируют еще дважды, используя по 30 куб. см хлористого метилена. К объединенной дихлорметановой фракции в делительной воронке вместимостью 250 куб. см приливают 25 куб. см водного раствора углекислого калия с молярной концентрацией 0,05 моль/куб. дм [(п. 8.1)](#p100113), содержимое интенсивно встряхивают в течение двух минут. После разделения фаз нижний органический слой, содержащий клотианидин, фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу и затем упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 10.3. ### 10.3. Очистка экстракта на колонке с флоризилом Сухой остаток экстрактов зерна, семян, масла или зеленой массы, полученный по [п. 10.2](#p100157), растворяют в 3 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по [п. 8.4](#p100121). Колбу обмывают 3 куб. см этилацетата, который также наносят на колонку. Колонку промывают 40 куб. см этилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Клотианидин элюируют из колонки 25 куб. см смеси этилацетат-ацетонитрил с объемным соотношением компонентов 1:1 непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток экстракта зерна, семян и масла растворяют в 5 куб. см, а зеленой массы в 12,5 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ [(п. 8.2)](#p100116), раствор помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. и анализируют на содержание клотианидина по [п. 11](#p100162). Полнота извлечения клотианидина при проведении всех операций подготовки пробы не менее 81%. ## 11. Выполнение измерений 11.1. В инжектор хроматографа вводят 5 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы ([пп. 10.1](#p100153) - 10.3), анализируют при условиях [(п. 7.2)](#p100103) и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды. 11.2. Для каждого образца повторяют операции по [пп. 10.1](#p100153) - 10.3, [11.1](#p100163). ## 12. Обработка результатов измерений 12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации. Альтернативная обработка результатов. По градуировочной характеристике находят значение массовой концентрации клотианидина в экстрактах, C, мкг/куб. см. Массовую долю клотианидина X, мг/кг, в образцах зерна, семян, масла и зеленой массы рассчитывают по формуле: C · V экстр X = ----------, (2) m · 0,81 где: C - значение массовой концентрации клотианидина в экстрактах, мкг/куб. см; V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, экстр куб. см; m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с флоризилом и последующего хроматографического определения, г; 0,81 - коэффициент извлечения клотианидина, учитывающий все процедуры подготовки пробы. 12.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости: 2 · |X - X | · 100 1 2 ------------------- <= r, (3) (X + X ) 1 2 где: X , X - результаты параллельных определений массовой доли 1 2 клотианидина, мг/кг; r - значение предела повторяемости, % [(табл. 1)](#p100029). Если [условие (3)](#p100172) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ. #### 12.3 Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде: $\overline{X} \pm 0,01 \cdot \delta \cdot \overline{X},\text{при }P = 0,95,$ где: $\overline{X}$ - среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/кг; $±\delta$ - границы относительной погрешности измерений, % [(табл. 1)](#p100029). В случае, если полученный результат измерений ниже нижней границы диапазона измерений, то результат анализа представляют в виде: "массовая доля клотианидина в зерне, семенах и масле менее 0,02 мг/кг"; "массовая доля клотианидина в зеленой массе менее 0,05 мг/кг". Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал клотианидина, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,2 мкг/куб. см, разбавляют, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой. ## 13. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости #### 13.1 Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят: а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями; б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля). 13.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение. 13.3. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R): 2 · |X - X | · 100 1 2 ------------------- <= R, (4) (X + X ) 1 2 где: X , X - результаты измерений массовой доли клотианидина, выполненных 1 2 в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг; R - предел воспроизводимости, % (при этом $R = 2,77 \cdot \sigma_{R}$ ). Если предел воспроизводимости не превышен, то приемлемы все результаты измерений и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если предел воспроизводимости превышен, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 [(п. 5.3.3)](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002#p100287). При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 [(п. 5.3.4)](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002#p100294). ---