МУК 4.1.3057-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой концентрации хлорэтанола в пробах крови методом капиллярной газовой хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 10.07.2013)
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
10 июля 2013 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ИЗМЕРЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ХЛОРЭТАНОЛА В ПРОБАХ КРОВИ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3057-13
<*> Свидетельство о метрологической аттестации от 15.12.2011 № 224.0516/01.00258/2011.
1. Назначение и область применения
Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газовой хроматографии для измерения массовой концентрации хлорэтанола в пробах крови в диапазоне 0,05 — 10 мкг/куб. см.
Методика предназначена для применения в санитарно-гигиенических, экологических, лечебных и научных организациях, осуществляющих деятельность в области профпатологии и экологии человека.
Методические указания носят рекомендательный характер.
2. Характеристика вещества
Хлорэтанол — бесцветная жидкость с эфирным запахом. Плотность 1,202 г/куб. см, температура кипения 128 °С, температура плавления — 89 °С. Хлорэтанол хорошо растворим в органических растворителях, в воде.
Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс 71 мг/кт, мышей 81 50 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC ) для мышей 385 мг/куб. м, для 50
крыс (LC ) 290 мг/куб. м; острая дермальная токсичность (LD ) для крыс
50 50
293 мг/кг, для мышей 18 мг/кг.
3. Требования к показателям точности измерений
3.1. Нормы погрешности измерений
Нормы погрешности измерений массовой концентрации хлорэтанола в пробах крови в нормативной документации не регламентированы.
3.2. Приписанные характеристики погрешности измерений и ее составляющих
Методика измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 1.
| Диапазон измерений, мкг/куб. см | Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), \sigma_{r} , % | Показатель воспроизводимости <2> (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), \sigma_{R} , % | Показатель правильности (границы относительной систематической погрешности при доверительной вероятности P = 0,95), \pm \delta_{c} , % | Показатель точности <1> (границы относительной погрешности при доверительной вероятности P = 0,95), \pm \delta , % |
| от 0,05 до 0,5 вкл. | 11 | 17 | 11 | 35 |
| св. 0,5 до 10,0 вкл. | 8 | 12 | 9 | 25 |
| -------------------------------- <1> Соответствует расширенной неопределенности U_{\text{отн}} (в относительных единицах) при коэффициенте охвата k = 2. <2> Оценен по результатам межлабораторного эксперимента (L = 2). | ||||
- при оценке деятельности лабораторий на качество проведения измерений;
- при оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.
4. Метод измерений
Выполнение измерений массовой концентрации хлорэтанола в экстракте пробы крови проводят методом капиллярной газовой хроматографии с электронно-захватным детектированием. Извлечение и концентрирование хлорэтанола из проб крови проводят методом жидкостно-жидкостной микроэкстракции диэтиловым эфиром с применением высаливания хлоридом натрия с последующим центрифугированием.
5. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений
| Газовый хроматограф с микроэлектронно-захватным детектором, автоинжектором и программой сбора и обработки данных | |
|---|---|
| Секундомер, цена деления секундной шкалы 0,2 с | ТУ 25-1894.003-90 |
| Колбы мерные 2 класса точности вместимостью 500 куб. см и пробирки мерные вместимостью 5 куб. см | ГОСТ 1770-74 |
| Дозаторы вместимостью 10 — 100 мкл с погрешностью 2%; вместимостью 0,1 — 1 куб. см с погрешностью +/- 0,5%; вместимостью 1 — 5 куб. см с погрешностью +/- 0,5% | ГОСТ 29227-91 |
| Весы лабораторные аналитические высокого класса точности с минимальным пределом взвешивания 0,1 мг | ГОСТ Р 53228-2008 |
| Гири | ГОСТ 7328-2001 |
Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
5.2. Реактивы
5.3. Вспомогательные устройства и материалы
Примечание: Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
6. Требования безопасности, охраны окружающей среды
6.1. При выполнении работ необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.
6.3. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-2009 и инструкцией по эксплуатации прибора.
6.4. При работе с газовыми баллонами соблюдают правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением, по ПБ 03-576-03.
6.5. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005-88.
6.6. Организуют обучение работающих безопасности труда по ГОСТ 12.0.004-90.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.
8. Условия измерений
9. Подготовка к выполнению измерений
При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы:
9.1. Подготовка хроматографа
Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации хроматографа.
9.2. Подготовка посуды
Используемую посуду необходимо замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе дихромата калия в серной кислоте, отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.
9.3. Приготовление 3%-го раствора дихромата калия
В термостойкий стакан вместимостью 2 куб. дм помещают 50 г дихромата калия, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 куб. дм концентрированной серной кислоты. Срок хранения - 1 год.
9.4. Подготовка хроматографической колонки
Хроматографическую колонку перед эксплуатацией устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (азота) с расходом 4 куб. см/мин. при температуре 240 °С в течение 2 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.
9.5. Приготовление градуировочных растворов
Для построения градуировочного графика готовят серию градуировочных растворов хлорэтанола в крови. Для приготовления градуировочных растворов используют свежеприготовленный раствор хлорэтанола в воде (с массовой концентрацией 23 мкг/куб. см) и кровь, не содержащую определяемых компонентов.
9.5.1 Приготовление основного раствора
В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 100 куб. см дистиллированной воды, дозатором вводят 10 куб. мм (эквивалентно 11,85 мг) хлорэтанола, перемешивают, доводят до метки дистиллированной водой и снова тщательно перемешивают. Массовую концентрацию хлорэтанола в основном растворе рассчитывают по формуле (1):
m · P · 1000<br>
хэ<br>
C = --------------, (1)
осн V
мк
где:<br>
C - концентрация хлорэтанола в основном растворе, мкг/куб. см;<br>
осн<br>
m - масса хлорэтанола, мг;<br>
хэ<br>
P - содержание основного вещества в хлорэтаноле;
V - объем мерной колбы, куб. см.
мк
Концентрация хлорэтанола в основном растворе составляет 23 мкг/куб. см. Срок хранения основного раствора хлорэтанола — 24 ч.
9.5.2 Приготовление градуировочных растворов
Серию образцов для градуировки, состоящую из 5 аттестованных смесей, готовят в мерных пробирках вместимостью 5 куб. см. Для этого в каждую мерную пробирку дозатором вводят основной раствор хлорэтанола в соответствии с табл. 2 и доводят до метки 5 куб. см кровью, не содержащей определяемый компонент.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГРАДУИРОВОЧНЫХ РАСТВОРОВ
Срок хранения градуировочных растворов — 24 ч.
9.6. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади хроматографического пика (Гц · с) от массовой концентрации хлорэтанола (мкг/куб. см) в крови, устанавливают по 6 сериям измерений по 5 концентрациям вещества в каждой серии для каждого диапазона в соответствии с табл. 3.
В две стеклянные хроматографические виалы вместимостью 1,5 куб. см помещают 0,36 г хлористого натрия, 1 куб. см градуировочного раствора, 0,5 куб. см диэтилового эфира. Виалы закрывают пластмассовой завинчивающей пробкой с тефлонированной мембраной (септой), затем помещают в мульти-вортекс и интенсивно перемешивают в течение 5 мин. После перемешивания виалы центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин. После центрифугирования виалы помещают в автоинжектор, который отбирает из виалы 5 мкл верхнего органического эфирного слоя на определенной глубине и вводит в испаритель хроматографа.
Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора, растворы хроматографируют в условиях:
Температурный режим термостата колонки: 90 °С с выдержкой 1 мин., подъем со скоростью 5 °С/мин. до 130° с выдержкой 1 мин.;
Режим расхода газа-носителя (азота): постоянный поток — 2 куб. см/мин.;
Режим испарителя: температура 160 °С; импульсный ввод 40 p.s.i. 0,75 мин.; деление потока 1:5;
Время удерживания хлорэтанола: 8.850 — 8.900 мин.
На полученных хроматограммах проводят идентификацию определяемого компонента по абсолютному времени удерживания и измеряют площади пика определяемого компонента. Каждую виалу хроматографируют 1 раз. По средним результатам параллельных определений (между двумя виалами) серии образцов для градуировки строят градуировочную характеристику.
9.7. Контроль стабильности градуировочной характеристики
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже одного раза в квартал или при смене партии реактивов. Средствами контроля являются вновь приготовленные образцы для градуировки (не менее 2 образцов из приведенных в п. 9.5.2).
Градуировочную характеристику считают стабильной при выполнении для каждого образца для градуировки следующего условия:
где:<br>
_
X - результат контрольного измерения массовой концентрации
определяемого компонента в образце для градуировки, мкг/куб. см; C — аттестованное значение массовой концентрации определяемого компонента в образце для градуировки, мкг/куб. см; K — норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, гр мкг/куб. см.
K_{\text{гр}} = 0,01 \cdot \delta \cdot C,(3)
где \delta — границы относительной погрешности.
Если условие стабильности градуировочной характеристики не выполняется только для одного образца для градуировки, необходимо выполнить повторное измерение этого образца для исключения результата, содержащего грубую погрешность.
Если градуировочная характеристика нестабильна, выясняют причины и повторяют контроль с использованием других образцов, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики строят новый градуировочный график.
10. Отбор проб
Отбор проб крови в объеме не менее 5 куб. см производится в вакуумные пробирки для забора крови с голубой крышкой. Анализ проб крови проводят непосредственно после отбора проб. Допускается хранение проб в морозильной камере не более 5 дней.
11. Порядок выполнения измерений
В две стеклянные хроматографические виалы вместимостью 1,5 куб. см помещают по 0,36 г хлористого натрия, 1 куб. см анализируемой пробы крови, 0,5 куб. см диэтилового эфира. Виалу закрывают пластмассовой завинчивающей пробкой с тефлонированной мембраной (септой), затем помещают в мульти-вортекс и интенсивно перемешивают в течение 5 мин. После перемешивания виалу помещают в центрифугу и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин. После центрифугирования виалу помещают в автоинжектор, который отбирает из виалы 5 мкл верхнего органического эфирного слоя на определенной глубине и вводит в испаритель хроматографа. Процедуру повторяют аналогично для второго образца (проводят два параллельных определения).
Хроматографирование проводят в условиях в соответствии с п. 9.6. Определяемый компонент идентифицируют по абсолютному времени удерживания. Абсолютное время удерживания определяемого компонента приведено в п. 9.6.
Для количественного расчета хроматограмм применяют метод абсолютной градуировки.
12. Обработка результатов измерений
12.1. На хроматограмме с помощью программы измеряют площадь пика и по градуировочному графику определяют массовую концентрацию хлорэтанола (X, мкг/куб. см).
12.2 За результат измерений массовой концентрации определяемого
_<br>
компонента в пробе (X, мкг/куб. см) принимают среднее арифметическое
значение результатов двух параллельных определений X и X , полученных в
1 2<br>
условиях повторяемости:
X + X
1 2
X = -------, (4)
2
для которых выполняется следующее условие:
_
X - X <= 0,01 · r · X, (5) 1 2
где r — значение предела повторяемости для двух результатов параллельных определений, % (табл. 3).
ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ И КРИТИЧЕСКОГО ДИАПАЗОНА ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ P = 0,95
При невыполнении условия (4) необходимо дополнительно получить еще два результата параллельных определений. Если при этом расхождение (X — max X ) результатов четырех параллельных определений равно или меньше min критического диапазона CR (4), то в качестве окончательного результата 0,95
принимают среднее арифметическое значение результатов четырех параллельных определений. Значение критического диапазона для четырех результатов
параллельных определений рассчитано по формуле (5) и значение в
относительных единицах приведено в табл. 3.
CR_{0,95}(4) = Q(0,95;4) \cdot \sigma_{r},(6)
Q(0,95;4) — коэффициент, зависящий от числа результатов единичных определений, полученных в условиях повторяемости и доверительной вероятности 0,95:
\sigma_{r} — среднеквадратическое отклонение повторяемости, % (табл. 1).
Если расхождение (X - X ) больше CR (4), в качестве max min 0,95 окончательного результата измерений может быть принята медиана четырех результатов параллельных определений. Кроме того, целесообразно выяснить причины появления неприемлемых результатов параллельных определений и
устранить их.
12.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости. При выполнении этого условия приемлемы оба результата измерений и в качестве окончательного может быть использовано их общее среднее значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 3.
При превышении предела воспроизводимости могут быть использованы методы оценки приемлемости результатов измерений согласно разделу 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и МИ 2881-2004.
13. Оформление результатов измерений
_
Результаты измерений массовой концентрации хлорэтанола X, мкг/куб. см, представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta)\text{либо }(\overline{X} \pm U),
\overline{X} — результат измерений массовой концентрации хлорэтанола, полученный в соответствии с процедурами раздела 12, мкг/куб. см;
\Delta — абсолютная погрешность измерений массовой концентрации хлорэтанола, мкг/куб. см, вычисляемая по формуле:
\Delta = 0,01 \cdot \delta \cdot \overline{X},(7)
где \delta — относительная погрешность измерений массовой концентрации хлорэтанола, по табл. 1, %;
U — расширенная неопределенность при k = 2, мкг/куб. см, вычисляемая по формуле:
_
где U - расширенная неопределенность (в относительных единицах) при
отн
k = 2 (табл. 1), %.
Примечание: числовые значения результата измерений оканчиваются цифрой того же разряда, что и значение показателя точности методики измерений (абсолютной погрешности измерений массовой доли определяемого компонента).
Допустимо результат измерений представлять в виде:
(\overline{X} \pm \Delta_{\text{л}}),\text{мкг}/\text{куб}.\text{см},
при условии \Delta_{\text{л}}<\Delta , где \Delta_{\text{л}} — значение показателя точности измерений (доверительные границы абсолютной погрешности измерений), установленное при реализации настоящего метода в лаборатории и обеспечиваемое контролем стабильности результатов измерений.
_
л
при условии U < U, где U - значение расширенной неопределенности,
л л
установленное при реализации настоящего метода в лаборатории и
обеспечиваемое контролем стабильности результатов измерений в лаборатории.
Примечание: при необходимости (в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО _ 5725-6-2002, раздел 5.2) для результата измерений X указывается количество параллельных определений и способ установления результата измерений.
14. Контроль качества результатов измерений
14.1 Контроль качества результатов измерений в лаборатории предусматривает:
- контроль исполнителем процедуры выполнения измерений;
- контроль стабильности результатов измерений (на основе контроля стабильности среднеквадратического отклонения повторяемости, среднеквадратического отклонения внутрилабораторной прецизионности, погрешности).
14.2. Контроль исполнителем процедуры выполнения измерений проводят на основе контроля внутрилабораторной прецизионности и погрешности.
14.2.1 Контроль внутрилабораторной прецизионности осуществляют путем
сравнения результатов измерений массовой концентрации определяемого компонента в пробе, полученных в условиях внутрилабораторной прецизионности. Расхождение между результатами измерений не должно превышать предела внутрилабораторной прецизионности (R ), выраженного в
л
единицах измеряемых содержаний
_ _ = |X - X | <= 0,01 · R · X, (9) 1 2 л
где:
_ _
X , X - результаты измерений массовой концентрации определяемого
1 2
компонента, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности,
мкг/куб. см; = X — среднее арифметическое значение результатов измерений, полученных в условиях внутрилабораторной прецизионности, мкг/куб. см; R — значение предела внутрилабораторной прецизионности, %. л
Значение R может быть приведено в Протоколе установленных показателей л качества результатов анализа при реализации методики измерений в лаборатории.
При невыполнении условия (8) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (8) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
14.2.2. Контроль погрешности с использованием образцов для контроля (ОК).
В качестве ОК используют аттестованные смеси по РМГ 60-2003. Контроль погрешности осуществляют путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры К с нормативом контроля К. Результат контрольной
к
процедуры К рассчитывают по формуле: к
_
где:
_
X - массовая концентрация определяемого компонента в ОК - среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений,
расхождение между которыми удовлетворяет условию (4), мкг/куб. см;
C - аттестованное значение ОК (массовая концентрация определяемого
компонента в аттестованной смеси), мкг/куб. см.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
\text{К } = \Delta_{\text{л}},(11)
где \Delta_{\text{л}} — значение характеристики погрешности результатов измерений, соответствующее массовой концентрации определяемого компонента в аттестованной смеси, рассчитанное по формуле:
\Delta_{\text{л}} = 0,01 \cdot \delta_{\text{л}} \cdot C.(12)
Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении условия:
При невыполнении условия (12) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (12) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
14.3. Периодичность контроля исполнителем процедуры выполнения измерений, а также реализуемые процедуры контроля стабильности результатов выполняемых измерений регламентируют во внутренних документах лаборатории.