МУК 4.1.3055-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств крезоксим-метила в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 05.07.2013)

5 июля 2013 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КРЕЗОКСИМ-МЕТИЛА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР, БОТВЕ И КОРНЕПЛОДАХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3055-13

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. № 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека — Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 5 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.121/01.0004343/2013 от 18.01.2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации крезоксим-метила в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/куб. дм.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Крезоксим-метил

(Е)-метил-2-метоксиимино-2-{2-(о-толилокси-метил)фенил}ацетат (IUPAC).

C_{18}H_{19}NO_{4}

Мол. масса: 313,4

Химически чистое вещество представляет собой белое кристаллическое вещество со слабым запахом.

Температура плавления: 97,2 — 101,7 °C.

Давление пара при 20 °C: 2,3\text{Ч}10^{- 3}\text{МПа} .

Растворимость (в г/куб. дм при 20 °C): вода — 0,002, гептан — 1,7, толуол — 111, дихлорметан — 939, метанол — 14,9, ацетон — 217, этилацетат — 123.

Стабильность к гидролизу при 20 °C: DT_{50} = 34\text{дня} (pH 7), 7 часов (pH 9). В биологически активных почвах в аэробных условиях крезоксим-метил быстро разрушается: DT_{90} = \text{менее}3\text{дней} .

Краткая токсикологическая характеристика: Острая пероральная токсичность DT_{50} для крыс более 5000 мг/кг, острая дермальная токсичность DT_{50} для крыс превышает 2000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и сенсибилизирующими свойствами. Не токсичен для пчел, дождевых червей, полезных насекомых и птиц.

Область применения препарата: синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Вещество эффективно против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков, овощных, кормовых, технических и плодовых культур. Обладает защитным, лечебным и искореняющим действием.

В России для крезоксим-метила гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

 Объект         Диапазон   Показатель     Показатель  Показа-   Показатель
 анализа        опреде-    повторяемости  внутрилабо- тель вос- точности

ляемых (относительное раторной произво- <*> (гра- концентра- среднеквадра- прецизион- димости, ницы отно- ций, мг/кг тическое ности, \sigma_{R} , % сительной отклонение \sigma_{R\text{л}} , % погрешно- повторяемо- сти), ±\delta , % сти), \sigma_{r} , %

 Зеленая масса  0,01 - 0,1       6           8         10          20

 Солома         0,01 - 0,1       6           8         10          20

 Зерно          0,01 - 0,1       7           8         11          23

 Ботва          0,01 - 0,1       7           8         11          23

 Корнеплоды     0,01 - 0,1       7           9         12          25

---

<*> Соответствует расширенной неопределенности U_{\text{отн}.} при коэффициенте охвата k = 2.

2. Метод измерений

Методика основана на определении крезоксим-метила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов ацетонитрилом, очистки экстракта промывкой гексаном и последующей очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация крезоксим-метила проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0,2 мг, ГОСТ 24104-2001.

Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0,1 г, ГОСТ 24104-2001.

Колбы мерные на 10, 100 и 250 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Микродозаторы одноканальные переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см, ГОСТ 50444.

Цилиндры мерные на 50 и 100 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Ацетонитрил, химически чистый, ТУ 6-09-3534-87.

Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная), ГОСТ Р 52501-2005.

н-Гексан, химически чистый, ТУ 6-09-3375-78.

Кислота ортофосфорная (H_{3}PO_{4}) , химически чистая, ГОСТ 6552-80.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М H_{3}PO_{4} в соотношении 50:50.

Смесь н-гексан-этилацетат в соотношении 9:1 по объему.

Крезоксим-метил, аналитический стандарт, 98,3%.

Этилацетат, химически чистый, ГОСТ 1138-84.

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства и материалы

Аналитическая колонка с функциональными группами C18, связанными этиленгибридными мостиками, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм.

Аппарат для встряхивания проб, ТУ 64-1-1081-73.

Воронки делительные вместимостью 250 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 25 и 100 куб. см, ГОСТ 9737-93.

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, 0,4 г, ТУ 4215-002-0545-931-94.

Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 куб. см.

Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар.

Фильтры бумажные средней плотности, ТУ 6.091678-86.

Центрифуга с максимальной рабочей частотой вращения 4000 об./мин.

Примечание: Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха 20 +/- 5 °C и относительной влажности не более 80%;

выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: 0,5 +/- 0,01 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.

7.2.3. Для приготовления ацетонитрила, насыщенного гексаном, в делительной воронке смешивают ацетонитрил и гексан в соотношении 5:1, встряхивают в течение 2 мин., после разделения слоев нижний ацетонитрильный слой готов к использованию.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см: точную навеску крезоксим-метила (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями крезоксим-метила 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50).

7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,2 куб. см основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 5,0 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,05 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.

При изучении полноты определения крезоксим-метила в зеленой массе, соломе и зерне зерновых колосовых культур, ботве и корнеплодах сахарной свеклы используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация крезоксим-метила в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

C = KS,

где S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|C - C_{\text{к}}|}{C} \text{Ч}100 \leq \lambda_{\text{контр}.} ,

где C — аттестованное значение массовой концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе;

C_{\text{к}} — результат контрольного измерения массовой концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе;

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10% при P = 0,95).

7.5. Подготовка патронов для очистки экстрактов

Два последовательно соединенных патрона для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля промывают последовательно 6 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему) и 4 куб. см гексана, после чего они готовы к работе.

7.6. Проверка хроматографического поведения крезоксим-метила на патронах

В круглодонную колбу емкостью 10 куб. см отбирают 1 куб. см стандартного раствора крезоксим-метила с концентрацией 1 мкг/куб. см. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 куб. см гексана и переносят на подготовленные патроны. Колбу обмывают 1 куб. см гексана и смыв тоже вносят на патроны. Промывают патроны 10 куб. см гексана, элюат отбрасывают. Затем элюируют крезоксим-метил смесью гексан:этилацетат (9:1, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в сек. Отбирают фракции по 2 куб. см, упаривают досуха, растворяют в 1 куб. см подвижной фазы (ацетонитрил — 0,005 М H_{3}PO_{4} , 50:50) и анализируют по п. 9.3.

Фракции, содержащие крезоксим-метил объединяют.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна». Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Отбор проб свеклы производится в соответствии с ГОСТ 1722-85 «Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая». Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят в герметично закрытой полиэтиленовой таре.

9. Проведение определения

9.1 Определение крезоксим-метила в зеленой массе, соломе

сахарной свеклы

Навеску измельченной пробы (10 г — зерно, корнеплоды; 5 г — зеленая масса, солома, ботва) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см и добавляют 40 куб. см ацетонитрила. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин., центрифугируют при скорости 4000 об./мин. в течение 10 мин., фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу. К остатку добавляют 30 мл ацетонитрила и проводят повторную экстракцию. Объединенные экстракты упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Остаток переносят в делительную воронку тремя 10 куб. см порциями ацетонитрила, насыщенного гексаном, и дважды промывают гексаном по 10 куб. см. Ацетонитрильный слой собирают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

9.2 Очистка на двух последовательных патронах

для твердофазной экстракции

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.1), количественно переносят двумя 1-куб. см порциями гексана на подготовленные патроны (п. 7.5). Промывают патроны 10 куб. см гексана. Крезоксим-метил элюируют 12 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему). Элюат количественно переносят в круглодонную колбу емкостью 25 куб. см и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50) и анализируют на содержание крезоксим-метила по п. 9.3.

9.3 Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм, заполненная сорбентом с функциональными группами C18, связанными этиленгибридными мостиками.

Температура колонки 30 +/- 1 °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 230 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание крезоксим-метила в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = \frac{S_{x}\text{×}K\text{×}V}{P} \text{×} \frac{100}{f} ,

где S_{x} — площадь пика крезоксим-метила на хроматограмме испытуемого образца, кв. мм (AU);

K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см;

P — навеска анализируемого образца, г;

f — полнота извлечения крезоксим-метила, приведенная в табл. 2, (%).

Таблица 2

РЕЗУЛЬТАТА ДЛЯ n = 20, P = 0,95

Анализируемый объект, мг/кг	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S, %	Доверительный интервал среднего результата, +/- %
Зеленая масса	0,01	0,01 — 0,1	89,5	2,65	1,32
Солома	0,01	0,01 — 0,1	89,8	2,36	1,18
Зерно	0,01	0,01 — 0,1	91,0	3,37	1,68
Ботва	0,01	0,01 — 0,1	92,2	3,31	1,65
Корнеплоды	0,01	0,01 — 0,1	88,7	7,46	3,73

Содержание остаточных количеств крезоксим-метила в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор крезоксим-метила с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

\frac{2\text{×}|X_{1} - X_{2}|\text{×}100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , (1)

где X_{1} , X_{2} — результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X}±\Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95,

где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;

\Delta = \delta\text{×}X100 ,

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,01 мг/кг <*>).»

---

<*> 0,01 мг/кг — предел обнаружения крезоксим-метила в зерне.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки \text{С}_{\text{д}} должна удовлетворять условию:

\text{С}_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X}\prime ,

где ±\Delta_{\text{л},X}(±\Delta_{\text{л},X}\prime) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

\Delta_{\text{л}} = ±0,84\Delta ,

\Delta = \delta\text{×}X100 ,

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

K_{\text{к}} = X\prime - X - C_{\text{д}} ,

где X', X, C_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} . (1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры ( K_{\text{к}} ) с нормативом контроля (K).

|K_{\text{к}}| \leq K , (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2\text{×}|X_{1} - X_{2}|\text{×}100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , (3)

где X_{1} , X_{2} — результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

---