МУК 4.1.3045-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточных количеств тебуконазола в зерне гороха, семенах и масле льна методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 08.10.2012)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ИЗМЕРЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТЕБУКОНАЗОЛА В ЗЕРНЕ ГОРОХА, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ЛЬНА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.085/01.00043/2012.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения в зерне гороха, семенах и масле льна массовой концентрации тебуконазола в диапазоне концентраций 0,05 — 0,5 мг/кг.

Название действующего вещества по ИСО: тебуконазол.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (RS)-1р-хлорфенил-4,4-диметил-3-(1H-1,2,4-триазол-1-ил метил)пентан-3-ил.

Структурная формула:

Температура плавления: 105 °C.

Давление паров при 20 °C — 1,7 \times 10^{- 3}mPa .

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_{ow}logP = 3,7 (20 °C).

Растворимость: в воде при 20 °C — 36 мг/дм3 (pH 5 — 9); гексане — < 0,1; изопропаноле, толуоле — 5 - 100; дихлорметане — > 200 (г/дм3 при 20 °C).

Вещество стабильно на свету, при повышенной температуре и гидролизу в чистой воде.

Краткая токсикологическая характеристика

Класс токсичности по ВОЗ — III, ЕПА — II.

Острая оральная токсичность (LD_{50}) для крыс 4000 мг/кг, дермальная — > 5000 мг/кг.

Гигиенические нормативы: МДУ в кукурузе (зерно) — 0,1 мг/кг, в сое (зерно, масло) — 0,1 мг/кг.

Область применения

Системный фунгицид широкого спектра действия для борьбы с болезнями листьев и колосьев зерновых (фузариоз, септориоз, ржавчина, мучнистая роса и др.), серой гнилью виноградной лозы, некоторыми заболеваниями сои, рапса, подсолнечника и др. Используется как протравитель семян на зерновых.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

для n = 20, P = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на определении тебуконазола методом капиллярной ГЖХ с использованием термоионного детектора после его извлечения из образцов органическими растворителями с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкими фазами и на колонке с флорисилом.

Идентификация тебуконазола проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

3.3 Вспомогательное оборудование и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/см2) необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением» ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом капиллярной газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную, методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 12.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Отбор и хранение проб

Отбор проб зерна гороха проводят в соответствии с ГОСТ 28674-90 «Горох. Требования по заготовке и поставке». Для длительного хранения аналитические пробы зерна гороха помещают в герметично закрытый двойной полиэтиленовый пакет и хранят в морозильной камере с температурой -18 °C.

Отбор семян льна масличного проводят в соответствии с ГОСТ 10582-76 и ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Масло хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев.

8. Подготовка к определению

8.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

8.2 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа капиллярную колонку, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °C до получения стабильной нулевой линии.

8.3 Приготовление растворов

8.3.1. Раствор ацетона 50%-й: в мерную колбу объемом 1000 см3 помещают 500 см3 ацетона и доводят объем до метки дистиллированной водой.

8.3.2. Элюент № 1 для колоночной хроматографии: в мерной колбе объемом 100 см3 смешивают 50 см3 н-гексана и 50 см3 этилацетата.

8.3.3. Элюент № 2 для колоночной хроматографии: в мерной колбе объемом 100 см3 смешивают 70 см3 н-гексана и 30 см3 этилацетата.

8.3.4. Элюент № 3 для колоночной хроматографии: в мерной колбе объемом 100 см3 смешивают 30 см3 н-гексана и 70 см3 этилацетата.

8.4 Приготовление основного и градуировочных растворов

8.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску тебуконазола (50 +/- 0,1) мг помещают в мерную колбу на 100 см3, растворяют в ацетоне и доводят до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 2,5 и 5,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя ацетон или гексан.

8.4.2. Раствор № 1 с концентрацией тебуконазола 5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 1 см3 основного раствора и доводят объем до метки ацетоном.

8.4.3. Раствор № 2 с концентрацией тебуконазола 2,5 мкг/см3: в мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 5 см3 основного раствора и доводят объем до метки ацетоном.

8.4.4. Раствор № 3 с концентрацией тебуконазола 2 мкг/см3: в мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 4 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки ацетоном.

8.4.5. Раствор № 4 с концентрацией тебуконазола 1 мкг/см3: в мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 5 см3 раствора № 3 и доводят объем до метки ацетоном.

8.4.6. Раствор № 5 с концентрацией тебуконазола 0,5 мкг/см3: в мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 5 см3 раствора № 4 и доводят объем до метки гексаном.

8.4.7. Раствор № 6 с концентрацией тебуконазола 0,25 мкг/см3: в мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 5 см3 раствора № 5 и доводят объем до метки гексаном.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы — в течение 2 недель.

Для внесения в образец семян льна или зерна гороха при определении полноты извлечения используют растворы тебуконазола, приготовленные из градуировочного раствора № 1 методом последовательного разбавления ацетоном.

Для внесения в образец масла льна при определении полноты извлечения используют растворы тебуконазола, приготовленные из градуировочного раствора № 2 методом последовательного разбавления гексаном.

8.5 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация тебуконазола в растворе) в хроматограф вводят по 1 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика (мв·с) от концентрации тебуконазола в градуировочном растворе (мкг/см3).

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|C - C_{\text{к}}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.} , где

C — аттестованное значение массовой концентрации тебуконазола в градуировочном растворе;

C_{\text{к}} — результат контрольного измерения массовой концентрации тебуконазола в градуировочном растворе;

8.6 Подготовка колонки с флорисилом для дополнительной очистки экстракта

8.7 Проверка хроматографического поведения тебуконазола на колонке с флорисилом

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 раствора тебуконазола с концентрацией 5 мкг/см3, отдувают растворитель током азота, растворяют сухой остаток в 2 см3 элюента № 1 и вносят в колонку с флорисилом. Раствору дают впитаться, после чего через колонку последовательно пропускают 20 см3 гексана и 10 см3 элюента № 2, элюат отбрасывают. Затем пропускают 40 — 50 см3 элюента № 3, отбирая фракции по 10 см3 каждая, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 ацетона и определяют концентрацию тебуконазола по п. 9.5. Фракции, содержащие тебуконазол объединяют, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 ацетона и анализируют по п. 9.5. Рассчитывают содержание тебуконазола, полноту вымывания тебуконазола из колонки и необходимый объем элюата № 3.

Примечание. Необходимо проверять профиль вымывания тебуконазола при использовании новой партии сорбента.

9. Проведение определения

9.1 Экстракция тебуконазола из зерна гороха

Навеску измельченного на лабораторной мельнице зерна гороха массой (10 +/- 0,1) г помещают в коническую колбу на 100 см3, заливают 50 см3 25%-го водного ацетона и экстрагируют тебуконазол в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через складчатый бумажный фильтр «красная лента» на воронке Бюхнера. Экстракцию повторяют дважды порциями водного ацетона по 50 см3. Осадок из колбы переносят на фильтр, ополаскивают колбу 20 см3 водного ацетона и промывают им осадок.

Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C до объема 10 см3. К полученному экстракту добавляют 40 см3 дистиллированной воды, 2 — 5 см3 насыщенного раствора хлористого натрия и экстрагируют тебуконазол по 30 см3 дихлорметана трижды, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 — 3 мин в делительной воронке объемом 250 см3. Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия в колбу-концентратор объемом 250 см3 и выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетона и 1 мм3 вводят в испаритель хроматографа.

При наличии мешающих примесей проводят дополнительную очистку на колонке с флорисилом по п. 9.4.

9.2 Экстракция тебуконазола из семян льна

Навеску измельченных семян льна массой (10 +/- 0,1) г помещают в коническую колбу объемом 100 см3 И экстрагируют тебуконазол 50 см3 ацетонитрила в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Полученную суспензию фильтруют через складчатый фильтр «красная лента» на воронке Бюхнера. Экстракцию повторяют дважды порциями ацетонитрила по 30 см3. Осадок из конической колбы переносят на фильтр, ополаскивают колбу 20 см3 ацетонитрила и промывают осадок.

9.3 Экстракция тебуконазола из льняного масла

Навеску масла (5 +/- 0,1) г растворяют в 10 см3 гексана в конической колбе на 100 см3 в УЗ-ванне в течение 15 мин. Полученный экстракт количественно переносят в делительную воронку объемом 250 см3 и экстрагируют тебуконазол трижды ацетонитрилом порциями по 30 — 50 см3, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 — 3 мин и собирая нижний ацетонитрильный слой.

Объединенный ацетонитрильный экстракт промывают гексаном и далее доводят до сухого остатка по п. 9.2.

При наличии метающих примесей проводят дополнительную очистку на колонке с флорисилом по п. 9.4.

9.4 Очистка экстрактов на колонке с флорисилом

9.5 Условия хроматографирования

Газовый хроматограф «Кристалл 2000 М» с ТИД, колонка кварцевая капиллярная длиной 30 м, диаметром 0,25 мм, неподвижная фаза НР-1, толщина слоя 0,25 мкм. Температура колонки программируется от 150 (15 с) до 250 °C со скоростью 20 °C/мин. Температура детектора 350 °C, испарителя 250 °C. Расход газа-носителя через колонку \text{Г}_{1} (азот) — 1,4 см3/мин (деление потока 1:7,5), водорода — 14,4 см3/мин, воздуха — 200 см3/мин. Расход газа \text{Г}_{3} (азот) — 10 см3/мин. Дозируемый объем — 1 мм3. Анализируемый объем — 1 см3. Время удерживания тебуконазола — 8 мин (35 +/- 5) с.

Линейный диапазон детектирования 0,25 — 5 нг.

9.6 Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание тебуконазола в образцах зерна гороха, семян или масла льна (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

P — навеска анализируемого образца, г;

C — концентрация тебуконазола в стандартном растворе, мкг/см3.

Содержание остаточных количеств тебуконазола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор тебуконазола 5 мкг/мл, разбавляют ацетоном.

10. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)

X_{1} , X_{2} — результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

11. Оформление результатов

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,05 мг/кг*, где «*» — 0,05 мг/кг — предел обнаружения тебуконазола в зерне гороха, семенах и масле льна).

12. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

12.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_{\text{к}} рассчитывают по формуле:

K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} .

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_{\text{к}}) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

12.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

X_{1} , X_{2} — результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

13. Разработчики