МУК 4.1.3044-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имидаклоприда в семенах и масле льна методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 08.10.2012)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 8 октября 2012 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
8 октября 2012 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИМИДАКЛОПРИДА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ЛЬНА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
с момента утверждения
1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений Россельхозакадемии.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 8 октября 2012 г.
3. Введены в действие с момента утверждения.
Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.090/01.00043/2012.
Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации имидаклоприда в семенах и масле льна в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг.
(Е)-1-(6-хлор-3-пиридилметил)-N-нитроимидазолидин-2-илиденамин (IUPAC)
(2Е)-1-[(6-хлор-3-пиридинил)метил]-N-нитро-2-имидазолидинимин (CAS)
C H ClN O 9 10 5 2
Химически чистый имидаклоприд: бесцветные кристаллы со слабым характерным запахом.
Температура плавления: 144 °С.
-7 -7 Давление паров: 4 · 10 мPa (20 °С), 9 · 10 мPa (25 °С). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K log P = 0,57 (21
ow
°С). Растворимость при 20 °С (г/л): в воде — 0,61; дихлорметане — 55; изопропаноле — 1,2; толуоле — 0,68; н-гексане < 0,1.
Гидролитически стабилен при pH 5 — 11.
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность LD для крыс — 450 мг/кг. Острая 50 дермальная токсичность (24 ч) для крыс LD > 5000 мг/кг. Не ирритант для 50 кожи и глаз (кролики). Острая ингаляционная токсичность LC (4 ч) для крыс 50
5323 мг/куб. м, 69 мг/куб. м воздуха (аэрозоль). LC (96 ч) для рыб — 50 211 (237) мг/л. Группа токсичности по ЕРА и ВОЗ — II. Мутагенной и тератогенной активности в стандартных тестах не обнаружено.
Системный инсектицид и инсекто-протравитель группы неоникотиноидов. Эффективно уничтожает листовую тлю, белок-рылку, минеров, трипсов, колорадского жука, долгоносиков на хлопчатнике, рисе, картофеле, кукурузе, сахарной свекле, овощных культурах, цитрусовых, косточковых и семечковых плодовых в течение вегетационного периода. Может использоваться для обработки как почвы, так и надземных органов растений.
Гигиенические нормативы для имидаклоприда в льне масличном не установлены.
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
Объект Диапазон Показатель Показатель Показатель Показатель анализа определя- повторяемости внутрила- воспроиз- точности <*> емых кон- (относительное бораторной водимости (границы центраций, среднеквадрати- прецизион- \sigma_{R}, % относитель- мг/кг, ческое отклоне- ности ной погреш- мг/куб. дм ние повторяемо- \sigma_{R\text{л}}, % ности) сти) \sigma_{r}, % ±\delta, %
Семена льна 0,01 - 0,1 7 8 11 23 Масло льна 0,01 - 0,1 7 8 11 23 <*> Соответствует расширенной неопределенности U (в относительных
отн.
единицах) при коэффициенте охвата k = 2.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ИМИДАКЛОПРИДА, СТАНДАРТНОЕ ОТКЛОНЕНИЕ,
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА
ДЛЯ n = 20, P = 0,95
| Анализируемый объект, мг/кг | Предел обнаружения | Диапазон определяемых концентраций | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/- % |
|---|---|---|---|---|---|
| Семена льна | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 94,3 | 4,6 | 4,2 |
| Масло льна | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 96,8 | 4,2 | 3,8 |
Методика основана на определении имидаклоприда методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов ацетонитрилом с последующей очисткой на концентрирующих патронах Диапак С.
Идентификация имидаклоприда проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
3.1 Средства измерений
Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с Номер в Госреестре быстросканирующим УФ-детектором, снабженным дегазатором, средств измерений автоматическим пробоотборником и термостатом колонки 42816-09
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-2001
Весы технические ВЛКТ-500 ГОСТ 24104-2001
Колбы мерные на 10, 25, 50, 100 куб. см ГОСТ 23932-90
Микродозаторы одноканальные "BIOHIT" переменного объема Номер в Госреестре от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см, Финляндия средств измерений
36152-07
Пипетки градуированные ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные на 50 и 100 куб. см ГОСТ 23932-90
pH-метр универсальный ЭВ-74 ГОСТ 22261-76
Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-200нм», сорт 5 или хч ТУ 6-09-3534-87
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, ГОСТ Р 52501-2005 деионизованная)
Имидаклоприд, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9% (Sigma-Aldrich)
Кислота серная, хч ГОСТ 4204-77
н-Гексан, хч, свежеперегнанный ТУ 2631-003- 05807999-98
Натрия гидроксид, хч ГОСТ 4328-77
Фосфора пентоксид, ч МРТУ 6-09-5759-69
Калий углекислый, хч ГОСТ 4221-76
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил — вода (20:80 по объему)
Элюент № 1: смесь гексан — этилацетат (50:50 по объему)
Этиловый эфир уксусной кислоты, чда ГОСТ 22300-76
Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
Аналитическая колонка: ACQUITY UPLC BEH C18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters)
Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)
Баня ультразвуковая «Серьга» ТУ 3.836.008 или аналогичная
Бумажные фильтры «красная лента» ТУ 6.091678-86
Воронки лабораторные В-75-110 ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС ГОСТ 10384-72
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 25 куб. см ГОСТ 9737-93
Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС ГОСТ 10384-72 Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ ТУ 1-01-0593-79
Патроны Диапак С (БиоХимМак СТ), 0,4 г (номер по каталогу 22.0300)
Ротационный вакуумный испаритель фирмы BUCHI, мод. R 205 (Швейцария)
Шприц медицинский с разъемом Льюера ГОСТ 22090
Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.
Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.
5. Требования к квалификации операторов
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 12.
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7.1 Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку Acquity BEH C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.
7.2 Подготовка и очистка реактивов и растворителей
Органические растворители при необходимости перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2% раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.
7.3 Подготовка концентрирующих патронов
для очистки экстракта
Патрон с силикагелем Диапак С промывают 2 куб. см этилацетата, затем 3 куб. см элюента № 1.
7.4 Приготовление растворов
Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с водой в соотношении 20:80 по объему, используя мерные цилиндры.
Приготовление элюента № 1: в колбе на 1000 куб. см смешивают 500 куб. см н-гексана и 500 куб. см этилацетата.
7.5 Приготовление основного и градуировочных растворов
7.5.1 Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см
Точную навеску имидаклоприда (50 мг) помешают в мерную колбу объемом 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят до метки.
Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя подвижную фазу.
7.5.2 Приготовление градуировочных растворов
Раствор № 1 с концентрацией имидаклоприда 1,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,2 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.
Раствор № 2 с концентрацией имидаклоприда 0,8 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят 8,0 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Раствор № 3 с концентрацией имидаклоприда 0,4 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят 4,0 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Раствор № 4 с концентрацией имидаклоприда 0,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят 2,0 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Раствор № 5 с концентрацией имидаклоприда 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят 1,0 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.
При изучении полноты извлечения имидаклоприда используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.
7.6 Построение градуировочного графика
Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация имидаклоприда в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации имидаклоприда в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:
где S — площадь пика градуировочного раствора.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
\frac{|C - C_{\text{к}}|}{C} 100 \leq \lambda_{\text{контр}},
где: С — аттестованное значение массовой концентрации имидаклоприда в градуировочном растворе; С — результат контрольного измерения массовой концентрации к имидаклоприда в градуировочном растворе; \lambda_{\text{контр}} — норматив контроля градуировочного коэффициента, %. ( \lambda_{\text{контр}} = 10% при P = 0,95).
Отбор проб семян льна производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Масло хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.
9.1 Определение имидаклоприда в пробах семян и масла льна
Навеску размолотых на лабораторной мельнице семян (10 +/- 0,1) г или масла (10 +/- 0,1) г помешают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 40 куб. см ацетонитрила и экстрагируют имидаклоприд в УЗ-бане в течение 15 мин. при температуре 30 °С. Экстракцию повторяют с двумя свежими порциями ацетонитрила по 30 куб. см. Объединенный экстракт промывают в делительной воронке двумя порциями гексана по 25 куб. см. Гексановые промывки отбрасывают. Ацетонитрильный раствор выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 40 °С. Далее пробу чистят на патроне Диапак С, как это описано в п. 9.2.
9.2 Очистка на патронах Диапак С
Сухой остаток, полученный по п. 9.1, растворяют в 1 куб. см элюента № 1, вносят в предварительно кондиционированный патрон, колбу ополаскивают 1 куб. см элюента № 1 и также вносят на патрон.
Патрон промывают 10 куб. см элюента № 1, элюат отбрасывают. Имидаклоприд элюируют 6 куб. см этилацетата, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С, остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм вводят в хроматограф.
9.3 Условия хроматографирования
Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.
Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 х 100) мм, 1,7 мкм (Waters).
Температура колонки (30 +/- 1) °С.
Подвижная фаза: смесь ацетонитрил — вода в соотношении 20:80 (по объему).
Скорость потока элюента 0,2 куб. см/мин.
Рабочая длина волны УФ-детектора 268 нм.
Объем вводимой пробы 10 куб. мм.
Время удерживания имидаклоприда составляет (4,3 +/- 0,2) мин.
9.4 Обработка результатов анализа
Содержание имидаклоприда в семенах и масле льна масличного (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:
S · С · V
2
где:
S - площадь пика имидаклоприда в стандартном растворе (мВ · с);
1
S - площадь пика имидаклоприда в анализируемой пробе (мВ · с);
2
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб.
см; Р — навеска анализируемого образца, г; С — концентрация стандартного раствора имидаклоприда, мкг/куб. см.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор имидаклоприда 1 мкг/куб. см) разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 · |Х - Х | · 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}).
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
(\overline{\text{Х}}±\Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95,
где: _ Х — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг; \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг.
\Delta = \frac{\delta \times \text{Х}}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,01 мг/кг)» <*>.
<*> 0,01 мг/кг — предел обнаружения имидаклоприда в семенах и масле льна.
12. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
12.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
12.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
\text{С}_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},\text{Х}} + \Delta_{\text{л},\text{Х }'},
где ±\Delta_{\text{л},\text{Х}}(±\Delta_{\text{л},\text{Х}'}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,
где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta \times \text{Х}}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
К = Х' - Х - С , к д где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 10) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля рассчитывают по формуле:
\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{Х }'}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}} .
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом к контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
12.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 · |Х - Х | · 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты измерений, выполненных в двух разных лабораториях,
1 2
мг/кг; R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.