МУК 4.1.3043-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой концентрации пропизохлора в ботве и корнеплодах свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 08.10.2012)

с момента утверждения

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ИЗМЕРЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ПРОПИЗОХЛОРА В БОТВЕ И КОРНЕПЛОДАХ СВЕКЛЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3043-12

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.084/01.00043/2012.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации пропизохлора в ботве свеклы в диапазоне концентраций 0,1 — 1,0 мг/дм3 в корнеплодах свеклы в диапазоне концентраций 0,025 — 0,25 мг/дм3.

Название действующего вещества по номенклатуре ICO: пропизохлор.

Название действующего вещества по номенклатуре IUPAC: 2-хлор-6'-этил-N-изопропоксиметилацето-о-толуидин.

Структурная формула:

Брутто формула: C_{15}H_{22}ClNO_{2} .

Молекулярная масса: 283,8.

Химически чистое вещество представляет собой маслянистую жидкость от светло-коричневого до пурпурного цвета с характерным запахом.

Температура плавления: 21,6 °C.

Давление пара при 20 °C: 4 мПа.

K_{ow}logP = 3,50 (20 °C).

Растворимость в воде — 184 мг/дм3. Растворим в большинстве органических растворителей. Гидролитически стабилен. Через 5 дней хранения при 50 °C (pH 4, 7, 9) степень разложения составляет менее 10%.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая оральная токсичность LD_{50} для крыс 3433 мг/кг (мужские особи) и 2088 мг/кг (женские особи).

Дермальная токсичность LD_{50} превышает 2000 мг/кг.

Ингаляционная токсичность LC_{50} — 5000 мг/м3 для животных обоих полов (крысы).

Область применения препарата

Селективный гербицид для регулирования роста однолетних трав и некоторых широколистных сорняков на посевах кукурузы, подсолнечника, сои, картофеля и гороха.

Механизм действия заключается в ингибировании деления клеток посредством блокирования белкового синтеза при адсорбции гербицида на корнях прорастающих растений.

В России для пропизохлора в свекле гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Таблица 2

стандартное отклонение, доверительный интервал среднего

2. Метод измерений

Методика основана на определении пропизохлора методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов с помощью «Набора для пробоподготовки по методу QuEChERS Interlab VetexQ для обычных овощей, фруктов и зерна (кат. № IL-5056)».

Идентификация пропизохлора проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

3.3 Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76 требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Acquity BEH C18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2 Приготовление растворов

7.2.1. 0,005 M раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3 растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 M раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 55:45 по объему, используя мерные цилиндры.

7.3 Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску пропизохлора (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями пропизохлора 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,0 и 2,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 55:45).

7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией 2,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 4 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,8 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 4 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,4 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.7. Раствор № 6 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.

При изучении полноты определения пропизохлора в ботве и корнеплодах сахарной свеклы используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.4 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация пропизохлора в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пропиконазола в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C — аттестованное значение массовой концентрации пропизохлора в градуировочном растворе;

\text{С}_{\text{к}} — результат контрольного измерения массовой концентрации пропизохлора в градуировочном растворе;

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб свеклы производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.1979 № 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ 1722-85 «Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая». Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят в закрытой полиэтиленовой таре.

9. Проведение определения

9.1 Определение пропизохлора в ботве и корнеплодах свеклы

В полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 помещают (10 +/- 0,1) г измельченной пробы (ботвы или корнеплодов), добавляют 10 см3 ацетонитрила и содержимое влагонепроницаемого пакета из «Набора для пробоподготовки по методу QuEChERS Interlab VetexQ для обычных овощей, фруктов и зерна (4\text{г }MgSO_{4} + 1\text{г }NaCl) ». Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате в течение 15 мин, центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают 5 см3 верхнего ацетонитрильного слоя и переносят в полипропиленовую центрифужную пробирку из набора вместимостью 15 см3, содержащую сорбент (150\text{мг }PSA<*> + 900\text{г }MgSO_{4}) . Добавляют 50 мг активированного угля, пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате в течение 15 мин, центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Аликвоту 2 см3 переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в подвижной фазе (корнеплоды в 0,5 см3, ботву в 1,0 см3) и 10 мм3 вводят в хроматограф.

Альтернативный вариант пробоподготовки

В полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 помещают (10 +/- 0,1) г измельченной пробы (ботвы или корнеплодов), прибавляют 10 см3 ацетонитрила, 0,1 см3 ледяной уксусной кислоты, 8 г семиводного магния серно-кислого и 1 г натрия уксусно-кислого. Пробирку плотно закрывают крышкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин и центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают 5 см3 верхнего ацетонитрильного слоя и переносят его в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 15 см3, содержащую 250 мг силикагеля, 750 мг безводного магния серно-кислого и 50 мг активированного угля. Пробирку плотно закрывают крышкой, встряхивают на аппарате 10 мин и центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин. Аликвоту 2 см3 переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в подвижной фазе (корнеплоды в 0,5 см3, ботву в 1,0 см3) и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.2 Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 55:45 (по объему). Скорость потока элюента 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3. Время удерживания пропизохлора (6,8 +/- 0,1) мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание пропизохлора в ботве и корнеплодах сахарной свеклы (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_{x} — площадь пика пропизохлора на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);

K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3:

k = 5 — коэффициент, учитывающий объем аликвоты экстракта, взятый для анализа;

f — полнота извлечения пропизохлора, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств пропизохлора в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пропизохлора с концентрацией 2,0 мкг/см3 разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)

r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,025 мг/кг*, где „*“ — 0,025 мг/кг — предел обнаружения пропизохлора в корнеплодах свеклы).»

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_{\text{д}} должна удовлетворять условию:

\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_{\text{к}} рассчитывают по формуле:

X', X, C_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}}

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_{\text{к}}) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X_{1} , X_{2} — результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

14. Разработчики