МУК 4.1.3042-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточных количеств имазалила в зерне гороха методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 08.10.2012)
Примечание
Документ введен в действие с 8 октября 2012 года.
УТВЕРЖДАЮ Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
8 октября 2012 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ИЗМЕРЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИМАЗАЛИЛА В ЗЕРНЕ ГОРОХА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3042-12
Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.083/01.00043/2012.
Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения в зерне гороха массовой концентрации имазалила в диапазоне концентраций 0,02 — 0,2 мг/кг.
Название действующего вещества по ИСО: имазалил.
Название действующего вещества по ИЮПАК: (+/-)-1-( \beta -аллилокси-2,4-дихлорфенилэтил) имидазол.
Эмпирическая формула: C_{14}H_{14}Cl_{2}N_{2}O .
Химически чистый имазалил представляет собой кристаллическую массу от светло-желтого до коричневого цвета с температурой плавления 52,7 °C, давлением паров 0,158 мРа (20 °C).
Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_{ow}logP = 3,82 (pH 9,2 буфер).
Растворимость при 20 °C (г/л): в воде — 0,18 (pH 7,6, 20 °C), в гексане — 19 г/л, ацетоне, дихлорметане, этаноле, метаноле, изопропаноле, бензоле, толуоле, ксилоле — более 500 г/л, растворим в гептане, петролейном эфире.
Стабилен к гидролизу в разбавленных кислотах и щелочах при комнатной температуре в отсутствие света. Стабилен к свету при нормальных условиях хранения. Стабилен при нагревании до 285 °C. В почве DT_{50} 4 — 5 дней, DT_{90} 54 — 68 дней.
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность для крыс LD_{50} 227 — 343 мг/кг. Дермальная токсичность для крыс LD_{50} 4200 — 4880 мг/кг. Класс токсичности по ВОЗ и ЕРА — II.
Гигиенические нормативы: МДУ в семенах подсолнечника, сои и рапса 0,02 мг/кг, в горохе не установлен.
1. Погрешность измерений
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Диапазон измерений, массовая концентрация, мг/кг | Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), \sigma_{r} , % | Показатель промежуточной прецизионности (относительное среднеквадратическое отклонение в условиях вариации факторов «время», «оператор» в одной лаборатории), \sigma_{R\text{л}} , % | Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), \sigma_{R} , % | Показатель точности <*> (границы относительной погрешности при вероятности P = 0,95), \pm \delta , % |
| Зерно гороха от 0,02 до 0,1 вкл. | 7 | 9 | 12 | 25 |
| Зерно гороха от 0,1 до 0,2 вкл. | 8 | 9 | 11 | 22 |
| <*> Соответствует расширенной неопределенности U_{\text{отн}} при коэффициенте охвата k = 2 | ||||
стандартное отклонение, доверительный интервал
среднего результата для n = 20, P = 0,95
2. Метод измерений
Методика основана на определении имазалила методом капиллярной ГЖХ с использованием термоионного детектора после его извлечения из образцов гороха органическими растворителями с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкими фазами и на колонке с силикагелем.
Идентификация имазалила проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1 Средства измерений
| Хроматограф газовый «Кристалл 2000М» с термоионным детектором | |
|---|---|
| Весы аналитические типа ВЛА-200 | ГОСТ 24104-2001 |
| Весы лабораторные типа ВЛКТ-500 | ГОСТ 24104-2001 |
| Колбы мерные со шлифом емкостью 50, 100 см3 | ГОСТ 1770-74 |
| Микрошприц МШ-10 | ТУ 2-833-106 |
| Пипетки мерные емкостью 1, 2, 5 и 10 см3 | ГОСТ 20292-74 |
| Пробирки мерные со шлифом емкостью 10,0 см3 | ГОСТ 1770-74 |
| Цилиндры мерные емкостью 50 и 100 см3 | ГОСТ 1770-74 |
Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
| Аналитический стандарт имазалила с массовой долей основного вещества 97,5% | |
|---|---|
| Азот газообразный, вч | ТУ 301-07-25-89 |
| Ацетон, осч | ТУ 2633-004-11291058-94 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ 7602-76 |
| н-Гексан, хч | ТУ 6-09-3375-78 |
| Дихлорметан, хч | ТУ 6-09-2662-77 |
| Натрий серно-кислый б/в (сульфат), чда | ГОСТ 4166-76 |
| Натрий хлористый, чда | ГОСТ 4233-77 |
| Элюенты для колоночной хроматографии: | |
| - элюент № 1 — гексан; | |
| - элюент № 2 — гексан-ацетон 19:1 (по объему); | |
| - элюент № 3 — гексан-ацетон 4:1 (по объему); | |
| - элюент № 4 — ацетон |
Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
Примечание. Допускается применение оборудования иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1007-76).
При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009 и инструкциями по эксплуатации приборов.
4.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.
4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/см2) необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением» ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.
5. Требования к квалификации операторов
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом капиллярной газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 12.
6. Условия измерений
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Отбор и хранение проб
Отбор проб зерна гороха проводят в соответствии с ГОСТ 28674-90 «Горох. Требования по заготовке и поставке». Для длительного хранения аналитические пробы зерна гороха помещают в герметично закрытый двойной полиэтиленовый пакет и хранят в морозильной камере с температурой -18 °C.
8. Подготовка к определению
8.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей
Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C до объема 1 см3 и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.
8.2 Кондиционирование колонки
Перед началом анализа капиллярную колонку, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °C до получения стабильной нулевой линии.
8.3 Приготовление растворов для очистки экстрактов
8.3.1. Элюент № 2 для колоночной хроматографии: в мерной колбе объемом 100 см3 смешивают 95 см3 н-гексана и 5 см3 ацетона.
8.3.2. Элюент № 3 для колоночной хроматографии: в мерной колбе объемом 100 см3 смешивают 80 см3 н-гексана и 20 см3 ацетона.
8.4 Приготовление градуировочных растворов
8.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску имазалила (50 +/- 0,1) мг помещают в мерную колбу на 100 см3, растворяют в ацетоне и доводят до метки тем же растворителем.
Градуировочные растворы с концентрациями 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя ацетон.
8.4.2. Раствор № 1 с концентрацией имазалила 2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,4 см3 основного раствора и доводят объем до метки ацетоном.
8.4.3. Раствор № 2 с концентрацией имазалила 1 мкг/см3: в мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки ацетоном.
8.4.4. Раствор № 3 с концентрацией имазалила 0,5 мкг/см3: в мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 5 см3 раствора № 2 и доводят объем до метки ацетоном.
8.4.5. Раствор № 4 с концентрацией имазалила 0,2 мкг/см3: мерную пробирку вместимостью 10 см3 вносят 4 см3 раствора № 3 и доводят объем до метки ацетоном.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы — в течение 2 недель.
Для определения полноты извлечения имазалила из образцов гороха используют градуировочные растворы в ацетоне.
8.5 Построение градуировочного графика
Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация имазалила в растворе) в хроматограф вводят по 1 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика (мв·с) от концентрации имазалила в градуировочном растворе (мкг/см3).
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:
S — площадь пика в градуировочном растворе.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
\frac{|\text{С } - \text{С}_{\text{к}}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.} , где
C — аттестованное значение массовой концентрации имазалила в градуировочном растворе;
\text{С}_{\text{к}} — результат контрольного измерения массовой концентрации имазалила в градуировочном растворе;
\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).
8.6 Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта
Силикагель не менее 5 ч прокаливают при 130 °C, охлаждают и хранят в эксикаторе. Навеску силикагеля 98,5 г помещают в круглодонную колбу и добавляют 1,5 г дистиллированной воды. Колбу плотно закрывают и интенсивно встряхивают в течение 5 мин. Затем колбу присоединяют к ротационному испарителю при атмосферном давлении и медленно вращают 2 ч. Деактивированный таким образом силикагель используют в течение 5 дней.
На дно стеклянной колонки помещают тампон из стекловаты, слой 0,5 см безводного сульфата натрия и заполняют суспензией 2 г силикагеля в 5 см3 гексана при открытом кране, сверху вносят слой 0,5 см безводного сульфата натрия и промывают колонку 10 см3 гексана. Когда уровень растворителя достигнет верхнего слоя в колонке, кран закрывают. Колонка готова к работе.
8.7 Проверка хроматографического поведения имазалила на колонке с силикагелем
На роторном испарителе при температуре не выше 40 °C упаривают досуха 5 см3 градуировочного раствора с известной концентрацией имазалила.
В колбу с сухим остатком вносят 2 см3 элюента № 1 и помещают колбу в ультразвуковую ванну на 5 мин. Затем пипеткой переносят раствор на колонку. Открывают кран и дают раствору впитаться. Когда уровень растворителя достигнет верхнего края колонки, кран закрывают. Колбу дважды ополаскивают 2 см3 элюента № 1 и пипеткой переносят раствор на колонку. Начинают элюирование в градуированную пробирку с притертой пробкой на 10 см3. После завершения пробирку закрывают и встряхивают. Таким образом, получена фракция с элюентом № 1.
Ту же колбу, где был сухой остаток, ополаскивают 2 см3 элюента № 2 и помещают колбу в ультразвуковую ванну на 5 мин. Затем пипеткой переносят раствор на колонку, колбу ополаскивают 2 см3 элюента № 2 и переносят на колонку. Таким образом, получена фракция с элюентом № 2.
Эту процедуру повторяют с элюентами № 3 и № 4 и, таким образом, готовят фракции с соответствующими элюентами.
Элюаты упаривают, сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетона и хроматографируют. Фракции, содержащие имазалил, объединяют, упаривают, сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетона и хроматографируют. Рассчитывают содержание имазалила в суммарном элюате, определяя полноту извлечения из колонки и необходимый для этого объем элюента.
Примечание. Профиль вымывания имазалила может изменяться при использовании силикагеля другой партии или марки.
8.8 Подготовка приборов и средств измерения
Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.
9. Проведение определения
9.1 Экстракция имазалила из зерна гороха
Навеску зерна гороха массой (10 +/- 0,1) г, размолотого на лабораторной мельнице, помещают в коническую колбу объемом 300 см3, добавляют 50 см3 теплой дистиллированной воды и оставляют на 30 мин для набухания. Затем добавляют 50 см3 ацетона и экстрагируют имазалил в ультразвуковой ванне в течение 5 мин.
Экстракт фильтруют через складчатый фильтр «белая лента» на воронке Бюхнера в коническую колбу на 300 см3. Экстракцию повторяют дважды по 50 см3 ацетона.
Объединенный экстракт помещают в морозильную камеру с температурой 18 °C на 2 — 3 ч. После этого экстракт фильтруют через бумажный фильтр «красная лента» в колбу-концентратор на 500 см3, фильтр и колбу ополаскивают 10 см3 охлажденного ацетона. Водно-ацетоновый экстракт упаривают до водного остатка при температуре не выше 40 °C на роторном испарителе. Водный остаток переносят в делительную воронку на 250 см3, добавляют 10 см3 насыщенного раствора хлористого натрия и 50 см3 дихлорметана, встряхивают в течение 2 мин и оставляют до полного расслоения. После разделения фаз дихлорметановый слой фильтруют в колбу-концентратор через слой безводного серно-кислого натрия, а водный слой возвращают в делительную воронку и повторяют экстракцию еще 2 — 3 раза порциями дихлорметана по 30 см3.
Объединенный фильтрат упаривают на ротационном испарителе до объема 2 см3 при температуре не выше 40 °C. Остатки растворителя удаляют в токе азота. Сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетона и хроматографируют. При наличии мешающих примесей дополнительную очистку проводят на колонке с силикагелем по п. 9.2.
9.2 Очистка экстрактов на колонке с силикагелем
В колбу с сухим остатком вносят 2 см3 элюента № 1 и растворяют его в ультразвуковой ванне в течение 5 мин. Пипеткой полностью переносят раствор на колонку. Открывают кран и дают пробе впитаться. Когда уровень растворителя достигнет верхнего края колонки, кран закрывают. Колбу ополаскивают 2 см3 элюента № 1, пипеткой переносят раствор на колонку и открывают кран. Элюат отбрасывают.
Продолжают элюирование, как описано в п. 8.7 элюентами № 2 и № 3. Элюаты отбрасывают.
Продолжают элюирование элюентом № 4. Собранную фракцию упаривают, сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетона и хроматографируют.
9.3 Условия хроматографирования
Газовый хроматограф «Кристалл 2000 М» с ТИД, колонка кварцевая капиллярная длиной 30 м, диаметром 0,25 мм, неподвижная фаза НР-1, толщина слоя 0,25 мкм. Температура колонки программируется от 150 °C (15 с) до 240 °C со скоростью 15 °C/мин. Температура термостата детектора 350 °C, испарителя 240 °C. Расход газа-носителя 1 (азот) — 1,7 см3/мин (деление потока 1:2,8), водорода — 14,4 см3/мин, воздуха — 200 см3/мин. Расход газа 3 (азот) — 10 см3/мин. Дозируемый объем — 2 мм3. Анализируемый объем — 1 см3. Время удерживания имазалила — 6 мин (54 +/- 5) с.
9.4 Обработка результатов анализа
Содержание имазалила в пробе рассчитывают методом внешнего стандарта по формуле:
X — массовая концентрация имазалила в пробе, мг/кг;
H — высота (площадь) пика анализируемого вещества, мм (мв·с);
H_{\text{ст}} — высота (площадь) пика аналитического стандарта, мм (мв·с);
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — навеска аналитической пробы, г.
Содержание остаточных количеств имазалила в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор имазалила 2 мкг/см3, разбавляют ацетоном.
10. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)
r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
11. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,02 мг/кг*, где „*“ — 0,02 мг/кг — предел обнаружения имазалила в зерне гороха).»
12. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
12.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
12.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки C_{\text{д}} должна удовлетворять условию:
\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X}\prime) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры K_{\text{к}} рассчитывают по формуле:
X', X, C_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле:
K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}}
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_{\text{к}}) с нормативом контроля (K).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
12.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):
X_{1} , X_{2} — результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.
13. Разработчики
Долженко В.И., Цибульская И.А., Карпова Л.М. (ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» Россельхозакадемии, Санкт-Петербург, Пушкин).