МУК 4.1.3041-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой концентрации бенз(а)пирена в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 07.09.2012)

Дата введения: с момента утверждения

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ИЗМЕРЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕНЗ(А)ПИРЕНА В МОЧЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3041-12

1. Разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора (Т. С. Уланова, Н. В. Зайцева, Е. В. Стенно, Г. А. Вейхман, М. А. Баканина, Ю. В. Шардакова, Т. Д. Карнажицкая, А. В. Кислицина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 7 сентября 2012 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

1. Область применения и общие положения

Свидетельство об аттестации от 30.11.2010 № 223.1.0273/01.00258/2010.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации бенз(а)пирена в моче в диапазоне 0,01-4,00 мкг/дм3.

1.2. Методические указания предназначены для использования органами и организациями Роспотребнадзора, а также иными организациями, деятельность которых связана с вопросами гигиены окружающей среды.

1.3 Бенз(а)пирен

Молекулярная масса — 252,32.

Бенз(а)пирен (3,4-бензпирен) — светло-желтые кристаллы, температура плавления 175-180,5 °С, температура кипения 456 °С, плотность 1,351-1,282 г/см3. Растворим в ацетонитриле, этаноле, метаноле, гексане, метиленхлориде и других органических растворителях [1]. Растворимость бенз(а)пирена в пресной воде 0,11 мкг/дм3, в соленой воде — 0,13 мкг/дм3 [2]. Присутствует в атмосферном воздухе, природной воде, растениях, копченых продуктах как загрязнитель.

Краткая токсикологическая характеристика

Бенз(а)пирен — вещество 1-го класса опасности. Обладает мутагенным, канцерогенным, эмбриотоксическим и тератогенным эффектами [3].

2. Погрешность измерений

Погрешность измерений, соответствует характеристикам, приведенным в табл. 1.

Таблица 1

воспроизводимости

Диапазон измерений, мкг/дм3	Показатели прецизионности (относительные значения), %			Показатель точности (границы
	стандартное отклонение повторяемости, сигма r	стандартное отклонение внутрилабораторной прецизионности, сигма Rл	стандартное отклонение воспроизводимости, сигма R	относительной погрешности при Р = 0,95), +/- дельта <*>, %
от 0,01 до 4,00 вкл.	3	7	10	20
<*> Соответствует расширенной относительной неопределенности при коэффициенте охвата k = 2.

3. Метод измерений

Измерение концентрации бенз(а)пирена в моче основан на концентрировании 3,4-бенз(а)пирена из мочи методом твердофазной экстракции на полимерном сорбенте Oasis HLB, экстракции с сорбента метиленхлоридом и анализе экстракта на жидкостном хроматографе с использованием флуориметрического детектора.

Определению не мешают ароматические углеводороды, фенол, стирол, полиядерные ароматические углеводороды.

Диапазон измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в моче — 0,01-4,00 мкг/дм3. Средняя полнота извлечения свободного бенз(а)пирена из мочи составляет 92%.

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

4.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф, оснащенный

термостатом колонок, градиентным насосом,         Номер в Государственном
устройством для дегазации элюента,                реестре средств измерений
флуориметрическим детектором                      16193-06

Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические ГОСТ Р 53228-2008 Гири Г2-210 ГОСТ 7328-2001 Колбы мерные вместимостью 25, 100 см3 ГОСТ 1770-74 Цилиндры мерные вместимостью 1 дм3 ГОСТ 1770-74 Пипетки градуированные вместимостью 1, 5, 10 см3 ГОСТ 29227-91 Микрошприцы Hamilton 700 вместимостью 10, 100 мм3; или дозаторы жидкости механические с погрешностью +/- 0,1 мм3; 0,1-1,0 см3; 1,0-5,0 см3 со сменными одноразовыми наконечниками, модель BIOHIT PROLINE

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2. Реактивы

Стандартный образец состава раствора бенз(а)пирена в ацетонитриле (аттестованное значение 100 мкг/см3), ГСО 7515 Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, осч ТУ 6-09-14-2167-84 Метилен хлористый для жидкостной хроматографии, осч ТУ 2631-013-44493179-98 Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72 Кислота серная, осч ГОСТ 14262-78

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

4.3. Вспомогательные устройства, материалы

Колонка металлическая Zorbax Eclipse XDB С18 с зернением 5 микрон 4,6 x 150 мм Предколонка Zorbax Eclipse XDB С18 с зернением 5 микрон 4,6 х 12,5 мм

Центрифуга ЦЛМН-Р10-01-"Элекон"                   ТУ 9443-001-245.23530-97
Сушильный шкаф ШСС-80                             ТУ 16.531.743-83

Устройство очистки воды «MilliPore» Устройство для твердофазной экстракции «Waters»: вакуумный насос и манифолд Картриджи Oasis HLB Icc (30 мг) для твердофазной экстракции «Waters» Пробирки типа Falcon полипропиленовые (РР) вместимостью 15 см3 конические с градуировкой с завинчивающейся крышкой Стакан термостойкий вместимостью 2 дм3 ГОСТ 25336-82 Стеклянные виалы объемом 1,5 см3 с крышкой Шприц медицинский одноразовый типа «Луер» вместимостью 1 см3 ГОСТ Р ИСО 7886-1-2009 Фильтры капроновые с диаметром пор

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5. Требования безопасности и охраны окружающей среды

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.1.005-88.

5.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают меры безопасности, указанные в руководстве по правилам эксплуатации прибора, правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009, противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и имеют средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83, обучение и инструктаж по безопасности труда проводится в соответствии с ГОСТ 12.0.004-90.

5.3 Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

5.4. При работе с биологическими средами необходимо соблюдать правила в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

5.5. При выполнении измерений на приборе соблюдают правила, указанные в руководстве по правилам эксплуатации жидкостного хроматографа.

6. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоившие метод анализа и получившие удовлетворительные результаты оперативного контроля процедуры выполнения измерений.

7. Условия измерений

7.1 Подготовку и проведение измерений проводят при следующих условиях:

• атмосферное давление (630-800) мм рт. ст.

7.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией прибора.

8. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

8.1. Подготовка посуды

Используемую стеклянную посуду замачивают на 1 ч. в хромовой смеси, промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают в сушильном шкафу при температуре 105 °С, ополаскивают ацетонитрилом.

8.2. Приготовление растворов

8.2.1. Элюент для хроматографии. Смесь ацетонитрила с дистиллированной водой в соотношении 60:40% (объемная доля). Состав элюента задают на двух каналах насоса.

8.2.2. Хромовая смесь. В термостойкий стакан вместимостью 2 дм3 насыпают 50 г калия двухромовокислого, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дм3 концентрированной серной кислоты.

8.2.3. Раствор метиленхлорида в ацетонитриле 1:10 (объемная доля). В мерную колбу объемом 25см3 вносят 2,27 см3 ацетонитрила, доводят метиленхлоридом до метки и перемешивают содержимое колбы. Срок хранения раствора 5 дней.

8.2.4. Раствор ацетонитрила в воде 50%-й (объемная доля). В мерную колбу объемом 25 см3 вносят 12,5 см3 ацетонитрила, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают содержимое колбы. Срок хранения раствора 5 дней.

8.2.5. Исходный раствор бенз(а)пирена № 1, концентрация 1 мкг/дм3. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 1,0 см3 ГСО бенз(а)пирена с концентрацией 100 мкг/дм3 и доводят ацетонитрилом до метки. Срок хранения раствора 60 дней при хранении в темном месте при температуре 4-6 °С.

8.2.6. Раствор бенз(а)пирена № 2, концентрация 0,025 мкг/дм3. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 2,5 см3 раствора бенз(а)пирена № 1 и доводят ацетонитрилом до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

8.2.7. Раствор для идентификации бенз(а)пирена, концентрация 0,005 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят 5 см3 раствора бенз(а)пирена № 2 для градуировки и доводят содержимое колбы ацетонитрилом до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

8.3. Подготовка хроматографической колонки

8.3.1. Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюент со скоростью 1,5 см3/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

8.3.2. Проводят холостую разгонку с установлением ступеней градиента: от 0 до 2,5 мин. — 60% ацетонитрила, от 2,5 до 12 мин. — повышение до 90% ацетонитрила, от 12 до 20 мин. — повышение до 100% ацетонитрила, от 20 до 22,5 мин. — 100% ацетонитрила, от 22,5 до 23 мин. — снижение до 60% ацетонитрила, от 23 до 28 мин. — 60% ацетонитрила.

8.4. Установление градуировочной характеристики

8.4.1. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме (единицы оптической плотности, е.о.п.) от массовой концентрации бенз(а)пирена (мкг/дм3), устанавливают на градуировочных растворах бенз(а)пирена в ацетонитриле методом абсолютной градуировки. Градуировочную характеристику устанавливают по результатам измерений 6 серий по 5 концентрациям вещества в каждой серии.

8.4.2. Градуировочные растворы готовят в мерных колбах вместимостью 25 см3. Для этого в каждую колбу вносят растворы бенз(а)пирена для градуировки № 1 и 2 в соответствии с табл. 2, доводят до метки ацетонитрилом и перемешивают.

Таблица 2

Градуировочные растворы бенз(а)пирена в ацетонитриле

Номер раствора	1	2	3	4	5
Объем раствора № 1 (С = 1 мкг/см3), мм3	-	-	-	46	92
Объем раствора № 2 (С = 0,025 мкг/см3), мм3	9,2	46	460	-	-
Массовая концентрация бенз(а)пирена в ацетонитриле, мкг/дм3	0,0092	0,046	0,46	1,84	3,68
Массовая концентрация бенз(а)пирена в моче (с учетом степени экстракции), мкг/дм3	0,010	0,05	0,50	2,0	4,0

8.4.3 Анализируют градуировочные растворы в количестве 20 мм3 на жидкостном хроматографе в условиях:

• колонка 4,6 x 150 мм, заполненная сорбентом Zorbax Eclipse XDB C_{18} ;

• градиент: 2,5 мин. подача подвижной фазы (60% ацетонитрила и 40% воды), увеличение ацетонитрила с 60 до 90% от 2,5 до 12 мин., увеличение ацетонитрила с 90 до 100% от 12 до 20 мин., подача 100% ацетонитрила от 20 до 22,5 мин., снижение ацетонитрила до 60% в течение 0,5 мин., подача 60% ацетонитрила до уравновешивания колонки (5 мин.);

  • скорость движения элюента 1,5 см3/мин. ;
  • температура термостата колонки 28 °С;
  • флуориметрический детектор:

           длина волны возбуждения                     265 нм;
           длина волны эмиссии                         412 нм;

- <a id="p100081"></a>время удерживания бенз(а)пирена:                 (12,5 +/- 0,05) мин.

K = \frac{\sum_{i = 1}^{n} C_{i}/S_{i}}{n} , где:

C_{i} — массовая концентрация бенз(а)пирена в градуировочном растворе, мкг/дм3;

S_{i} — среднее значение двух измерений площади пика бенз(а)пирена i-й концентрации, усл. ед.;

8.4.4 Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация бенз(а)пирена соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

С — заданная массовая концентрация бенз(а)пирена в градуировочном растворе, мкг/дм3;

X — результат измерения массовой концентрации бенз(а)пирена в градуировочном растворе, мкг/дм3.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

8.5. Отбор проб

Отбирают пробу мочи объемом не менее 20 см3 в стеклянную тару с плотно закрывающейся крышкой. Срок хранения проб в холодильнике 8 ч.

9. Выполнение измерений

Выполняют два параллельных измерения образца мочи. В коническую пробирку с завинчивающейся крышкой переносят 10,0 см3 мочи и центрифугируют со скоростью 2000 об./мин. в течение 5 мин. Отбирают 1,0 см3 верхнего слоя и проводят твердофазную экстракцию, последовательно пропуская под вакуумом через картридж с сорбентом Oasis HLB 1cc 1 см3 раствора метиленхлорида в ацетонитриле (1:10), 1 см3 дистиллированной воды, 1 см3 анализируемой мочи, промывают картридж с нанесенной пробой 1 см3 дистиллированной воды, 0,2 см3 50%-го раствора ацетонитрила в воде. Высушивают картридж в токе воздуха с помощью вакуумного насоса и пропускают через сорбент 1 см3 метиленхлорида, собирая экстракт в виалу. Скорость потока во время экстракции не должна превышать 1 см3/мин. Полученный экстракт высушивают в токе воздуха, растворяют сухой остаток в 1,0 см3 ацетонитрила, фильтруют раствор через капроновый фильтр, используя медицинский шприц «Луер», в стеклянную виалу, и анализируют в количестве 20 мм3 на жидкостном хроматографе в условиях, указанных в п. 8.4.3.

Идентификацию бенз(а)пирена проводят путем сравнения времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и стандартном растворе.

10. Обработка (вычисление) результатов измерений

10.1 Массовую концентрацию бенз(а)пирена в моче (мкг/дм3) вычисляют по формуле:

X = S_{i} \cdot K \cdot 1,087 , где:

X — массовая концентрация бенз(а)пирена в анализируемой пробе, мкг/дм3;

S_{i} — площадь пика бенз(а)пирена на хроматограмме, усл. ед.;

K — градуировочный коэффициент;

1,087 — коэффициент, учитывающий степень экстракции бенз(а)пирена из мочи, равную 92%. Рассчитывается как отношение площадей пиков бенз(а)пирена до и после экстракции из мочи.

10.2. За результат измерения \overline{X} принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости X_{1} , X_{2} (параллельных определений), для которых выполняется условие:

r — предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (1) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

|X_{max,4} - X_{min,4}| \leq 0,01 \cdot CR_{0,95}(4) \cdot \frac{X_{1} + X_{2} + X_{3} + X_{4}}{4} , где: (2)

CR_{0,95}(4) — критический диапазон. CR_{0,95}(4) = 11\% .

При невыполнении условия (2) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условия (1).

Таблица 3

Пределы повторяемости, внутрилабораторной прецизионности, воспроизводимости при вероятности Р = 0,95

Диапазон измерений,	Пределы (относительные значения), %
мкг/дм3	повторяемости (допускаемое расхождение между двумя результатами параллельных определений), r	внутрилабораторной прецизионности (допускаемое расхождение между двумя результатами измерений, полученными в условиях внутрилабораторной прецизионности), Rл	воспроизводимости (допускаемое расхождение между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), R
от 0,01 до 4,0 вкл.	8	20	28

10.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости:

|\overline{X_{1}} - \overline{X_{2}}| \leq 0,01 \cdot R \cdot \frac{\overline{X_{1}} + \overline{X_{2}}}{2} , где: (3)

\overline{X_{1}} и \overline{X_{2}} , — результаты измерений массовой концентрации бенз(а)пирена, полученные в разных лабораториях — средние арифметические двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие (1), мкг/дм3.

При выполнении условия (3) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 3.

11. Оформление результатов измерений

Результат измерений в документах, предусматривающих его использование, может быть представлен в виде:

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мкг}/\text{дм}^{3} , Р = 0,95, где:

\Delta — характеристика погрешности, мкг/дм3, при Р = 0,95, значение \Delta рассчитывают по формуле:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где:

Значение \delta приведено в табл. 1.

12. Процедуры обеспечения достоверности измерений

Обеспечение достоверности измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и РМГ 76-2004 ГСИ.

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

12.1. Алгоритм оперативного контроля процедуры измерений с использованием метода добавок

Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры \text{К}_{\text{к}} с нормативом контроля К.

\text{К}_{\text{к}} = |\overline{X\prime} - \overline{X} - C_{\text{д}}| , где:

\overline{X\prime} — результат измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в пробе с известной добавкой — среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (1), мкг/дм3;

\overline{X} — результат измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в исходной пробе — среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (1), мкг/дм3;

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} , где:

\Delta_{\text{л},X\prime} , \Delta_{\text{л},X} — значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики измерений, соответствующие массовой концентрации бенз(а)пирена в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно, мкг/дм3.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики измерений в лаборатории устанавливать на основе выражения: \Delta_{\text{л}} = 0,84 \cdot \Delta с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

\text{К}_{\text{к}} \leq \text{К} (4)

При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

12.2. Алгоритм проведения контрольной процедуры при контроле внутрилабораторной прецизионности

Контрольные процедуры при контроле промежуточной прецизионности получают с использованием рабочих проб мочи.

При реализации контрольной процедуры получают два результата контрольных измерений (первичного \overline{X_{1}} и повторного \overline{X_{2}} ) массовой концентрации бенз(а)пирена в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:

|\overline{X_{1}} - \overline{X_{2}}| \leq 0,01 \cdot R_{\text{л}} \cdot \frac{\overline{X_{1}} + \overline{X_{2}}}{2} (5)

Значение предела внутрилабораторной прецизионности ( R_{\text{л}} , %) не превышает 20%.

13. Разработчики

Уланова Т.С., Зайцева Н.В., Карнажицкая Т.Д., Кислицина А.В. (ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора).

Приложение 1 (справочное)

Библиография

1. Химическая энциклопедия/Под ред. И. Л. Кнунянц, М.: «Советская энциклопедия», 1988. Т. 1.

2. Майстренко В.Н., Клюев Н.А. Эколого-аналитический мониторинг стойких органических загрязнителей. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2004. 323 с.

3. Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности. Т. 1. Органические вещества. Л.: Химия, 1976. 590 с.

Приложение 2

(справочное)

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие документы.

ГОСТ Р 53228-2008 «Весы неавтоматического действия. Ч. 1. Метрологические и технические требования. Испытания».

ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия».

---