--- title: "\"МУК 4.1.3028-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифеноконазола в бананах, цитрусовых (мякоть, сок) и зерне риса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания\"" number: "МУК 4.1.3028-12" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/muk-4-1-3028-12" --- ## "МУК 4.1.3028-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифеноконазола в бананах, цитрусовых (мякоть, сок) и зерне риса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания" # "МУК 4.1.3028-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифеноконазола в бананах, цитрусовых (мякоть, сок) и зерне риса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания" (утв. Роспотребнадзором 03.07.2012) > [!IMPORTANT] > Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 N 299). > Документ [введен](#p100002) в действие с 3 июля 2012 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
3 июля 2012 года
#### 4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ **ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИФЕНОКОНАЗОЛА В БАНАНАХ,** **ЦИТРУСОВЫХ (МЯКОТЬ, СОК) И ЗЕРНЕ РИСА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ** **ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.1.3028-12** Дата введения:
с момента утверждения
1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора. 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 3 июля 2012 г. 4. Введены в действие с момента утверждения. 5. Введены впервые. Свидетельство о метрологической аттестации N 00120.22.05.12 от 22.05.2012. Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций дифеноконазола в бананах, цитрусовых и рисе в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг. Дифеноконазол
4-хлорфениловый эфир цис, транс-3-хлор-4-[4-метил-2-(1Н-1,2,4-триазол-1-илметил)-1,3-диоксолан-2-ил]фенила(ИЮПАК) ![рис. 1](https://i.bukva.ai/TCdQe1Mz/img_0.png)
C H Cl N O 19 17 2 3 3 Мол. масса 406,3 Соотношение цис и транс-изомеров от 0,7 до 1,5. Кристаллическое вещество от белого до светло-бежевого цвета. -5 Температура плавления 78,6 °C. Давление паров при 25 °C: 3,3 х 10 мПа. Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм): этанол - 330; н-гексан - 3,4; толуол - 490; ацетон - 610. Растворимость в воде при 20 °C (мг/куб. дм): 15. Коэффициент распределения н-октанол - вода (20 °C) K log P = 4,2. Вещество устойчиво к гидролизу и фотолизу ow (при естественном солнечном свете DT = 145 дней). Дифеноконазол быстро 50 сорбируется почвой и медленно разрушается. Краткая токсикологическая характеристика Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс - 1453 мг/кг, 50 мышей - > 2000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для кроликов > 50 2010 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC ) для крыс > 3300 50 мг/куб. дм (4 ч). Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел и дождевых червей. Область применения препарата Дифеноконазол - системный фунгицид и протравитель семян. Обладает длительным защитным и лечебным действием против широкого круга растительных патогенов из классов аскомицетов, базилиомицетов, дейтеромицетов, включая возбудителей альтернариоза, септориоза, церкоспороза, парши и других патогенов. ## 1. Метрологические характеристики При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Таблица 1
**МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ** Анали- Диапазон Показатель Стандарт- Предел Предел Норматив зируе- определяемых точности ное от- повто- воспро- оперативного мый концентраций, (граница клонение ряемос- изводи- контроля объект мг/кг относи- повторяе- ти, r, мости, точности, К, тельной мости, % R, % мг/кг погрешнос- $\sigma_{r}$ , % (P = 0,95, ти), $\pm \delta$ , %, m = 2) P = 0,95 1 2 3 4 5 6 7 Бананы от 0,01 до 50 2,4 8 11 0,59 х $\overline{X}$ 0,1 вкл. Зерно от 0,01 до 50 2,9 8 11 0,59 х $\overline{X}$ риса 0,1 вкл. Мякоть от 0,01 до 50 2,5 7 10 0,59 х $\overline{X}$ цитру- 0,1 вкл. совых Сок от 0,01 до 50 2,6 8 11 0,59 х $\overline{X}$ цитру- 0,1 вкл. совых $\overline{X}$ - среднее значение массовой концентрации анализируемого компонента в пробе (мг/кг). Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2. Таблица 2 Анали- Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 зируемый ──────────────────────────────────────────────────────────────── объект Предел Диапазон Полнота Стандартное Доверительный обнаруже- определяемых извлечения отклонение, интервал ния, концентраций, вещества, $\delta$ , % среднего мг/кг мг/кг $\delta$ , % результата, +/-, % Бананы 0,01 0,01 - 0,1 91,48 2,8 1,5 Зерно риса 0,01 0,01 - 0,1 85,71 3,4 1,8 Мякоть 0,01 0,01 - 0,1 91,55 3,1 1,7 цитрусовых Сок 0,01 0,01 - 0,1 93,10 3,3 1,8 цитрусовых ## 2. Метод измерений Метод основан на экстракции дифеноконазола из исследуемой пробы растворителем, очистке экстрактов от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей, далее на колонке с силикагелем (бананы, цитрусовые (мякоть, сок) и зерно риса) и на концентрирующем патроне Sep Pak Classik C18 (зерно риса, цитрусовые (мякоть и сок) с последующим измерением содержания дифеноконазола методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с электронно-захватным детектором (ЭЗД) при программировании температуры и обработкой хроматограмм методом абсолютной калибровки. ## 3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы ### 3.1. Средства измерений Газовый хроматограф "Кристалл-2000М", снабженный Номер Госреестра электронно-захватным детектором с пределом 14516-08 -14 детектирования по Линдану 3,5 х 10 г/с, предназначенный для работы с капиллярной колонкой Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные общего назначения с наибольшим ГОСТ 24104-2001 пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г Колбы мерные вместимостью 2-100-2 [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) Меры массы ГОСТ 7328-2001 Микрошприц типа SGE-Cromatek вместимостью 10 куб. мм Номер Госреестра 39206-08 Пипетки градуированные 2-го класса точности [ГОСТ 29227-91](https://bukva.ai/docs/gost-29227-91) вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) 50, 100 и 250 куб. см *Примечание.* Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками. ### 3.2. Реактивы Дифеноконазол, аналитический стандарт с содержанием ГСО 7656-99 действующего вещества 99,1% (абсолютное значение погрешности +/- 0,9% (НПК "Блок-1") Азот газообразный нулевой, марка А (99,999%), в баллонах ТУ 6-21-39-96 Ацетонитрил для хроматографии, осч; УФ-210 нм ТУ 6-09-14-2167-84 Ацетон, осч ГОСТ 2603-79 Вода для лабораторного анализа (деионизованная, [ГОСТ Р 52501-2005](https://bukva.ai/docs/gost-r-52501-2005) бидистиллированная) н-Гексан (гексан) для ВЭЖХ ТУ 6-09-06-657-84 Калий марганцовокислый (перманганат калия), хч ГОСТ 20490-75 Калий углекислый (карбонат калия, поташ), хч [ГОСТ 4221-76](https://bukva.ai/docs/standart-gost-4221-76) Кислота серная концентрированная, хч ГОСТ 4204-77 Метиловый спирт (метанол), хч [ГОСТ 6995-77](https://bukva.ai/docs/standart-gost-6995-77) Натрий серно-кислый (сульфат натрия) безводный, хч [ГОСТ 4166-76](https://bukva.ai/docs/gost-4166-76) Натрий углекислый (карбонат натрия), хч ГОСТ 83-79 Натрий хлористый, хч, насыщенный водный раствор ГОСТ 4233-77 Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид ТУ 6-09-4173-85 фосфора) Эфир диэтиловый, чистый для анализа ТУ 2600-001-45682126-11 *Примечание.* Допускается использование реактивов иных производителей с более высокой квалификацией. ### 3.3. Вспомогательные устройства, материалы Алюминия окись II Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78 Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария) Барометр-анероид с диапазоном измерений от 79,5 ТУ 25-11-1316-76 до 106,5 и ценой деления 0,1 кПа типа М-98 Бумажные фильтры "красная лента" обеззоленные или ТУ 2642-001-05015242-07 фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ Воронка Бюхнера ГОСТ 9147-80 Воронка делительная вместимостью 250 куб. см [ГОСТ 9737-93](https://bukva.ai/docs/standart-gost-9737-93) Воронки стеклянные конусные типа В-36-80 ХС ГОСТ 25336-82 и В-56-80 ХС Гигрометр с диапазоном измерений относительной ТУ 25-11-1645-84 влажности от 30 до 90% типа ВИТ-2 Груша резиновая ТУ 9398-05-0576-9082-2003 Колба Бунзена ГОСТ 25336-82 Колбы конические (плоскодонные) вместимостью 100, ГОСТ 23932-90 250 - 300 куб. см Колбы круглодонные на шлифе (для упаривания) [ГОСТ 9737-93](https://bukva.ai/docs/standart-gost-9737-93) вместимостью 10, 100, 250 куб. см Колонка стеклянная для препаративной хроматографии длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм Концентрирующий патрон Sep Pak Classik C18 Cartidges (360 mg), (Waters, США) Мельница электрическая бытовая ГОСТ Р 52161.1-2004 Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 25336-82 Стаканы химические вместимостью 100, 250 куб. см ГОСТ 25336-82 Силикагель для колоночной хроматографии 0,2 - 0,5 мм, 40 А Стекловата Стеклянные палочки Термометр с диапазоном измерений от 0 до 55 °C и [ГОСТ 28498-90](https://bukva.ai/docs/gost-28498-90) ценой деления 0,1 °C Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 30 Ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария Установка для перегонки растворителей Хроматографическая колонка капиллярная НР-35 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм Шприц медицинский с разъемом Льюера вместимостью ГОСТ 22090 10 куб. см *Примечание.* Допускается использование других вспомогательных средств измерений и устройств иных производителей, технические характеристики которых не уступают указанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений. ## 4. Требования безопасности 4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф. 4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны" и ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90. 4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/кв. см), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор. ## 5. Требования к квалификации операторов К выполнению измерений допускают специалиста, имеющего квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе, освоившего данную методику и подтвердившего экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по [п. 13](#p100226). К проведению профподготовки допускают оператора с квалификацией лаборант, имеющего опыт работы в химической лаборатории. ## 6. Условия измерений При выполнении измерений соблюдают следующие условия: - процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%; - выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору. ## 7. Подготовка к выполнению измерений Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения дифеноконазола на ней, подготовка концентрирующих патронов Sep Pak Classik C18, проверка поведения вещества на них. ### 7.1. Очистка органических растворителей ##### 7.1.1 Ацетон Ацетон перегоняют над небольшим количеством марганцовокислого качия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. 7.1.2. н-Гексан Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия. ##### 7.1.3 Ацетонитрил Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила - 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила - 10 г карбоната калия). ##### 7.1.4 Диэтиловый эфир Растворитель проверяют на присутствие перекисей. Перекись удаляют путем пропускания растворителя через короткую колонку (диаметр колонки 3 - 4 см, высота сорбента 5 - 6 см), наполненную окисью алюминия. Применение активированной окиси алюминия позволяет одновременно высушивать растворитель. ### 7.2. Приготовление градуировочных растворов 7.2.1. Исходный раствор дифеноконазола для градуировки (концентрация 250 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,025 г дифеноконазола, растворяют в 50 - 70 куб. см смеси гексан:ацетон (8:2 по объему), доводят до метки этой же смесью, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев. 7.2.2. Раствор N 1 дифеноконазола для градуировки (концентрация 2,5 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1,0 куб. см исходного раствора дифеноконазола для градуировки с концентрацией 250 мкг/куб. см [(п. 7.2.1)](#p100126), доводят до метки смесью гексан:ацетон (8:2 по объему), тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца. 7.2.3. Рабочие растворы N 2 - 5 дифеноконазола для градуировки (концентрация 0,025 - 0,25 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 4,0 и 10 куб. см раствора N 1 дифеноконазола с концентрацией 2,5 мкг/куб. см [(п. 7.2.2)](#p100127), доводят до метки смесью гексан:ацетон (8:2 по объему), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией дифеноконазола 0,025; 0,05; 0,1 и 0,25 мкг/куб. см соответственно. Растворы N 2 - 5 готовят непосредственно перед использованием. ### 7.3. Установление градуировочной характеристики Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (S, мВ х сек.) от концентрации дифеноконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки N 2 - 5. В инжектор хроматографа вводят 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по [п. 9.5](#p100190). Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков действующего вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость. ### 7.4. Приготовление смесей для приготовления градуировочных растворов и очистки экстрактов на колонке 7.4.1. Смесь гексан:ацетон (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 80 куб. см гексана и 20 куб. см ацетона, перемешивают. 7.4.2. Смесь гексан:ацетон (объемное соотношение 95:5). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 95 куб. см гексана и 5 куб. см ацетона, перемешивают. 7.4.3. Смесь гексан:ацетон (объемное соотношение 9:1). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 90 куб. см гексана и 10 куб. см ацетона, перемешивают. 7.4.4. Смесь гексан:ацетон (объемное соотношение 7:3). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 70 куб. см гексана и 30 куб. см ацетона, перемешивают. 7.4.5. Смесь гексан:диэтиловый эфир (объемное соотношение 4:1). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 80 куб. см гексана и 20 куб. см диэтилового эфира, перемешивают. ### 7.5. Приготовление смесей для очистки экстрактов на концентрирующем патроне Sep Pak Classik C18 7.5.1. Смесь ацетонитрил:вода (объемное соотношение 1:9). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см ацетонитрила и 90 куб. см воды, перемешивают. 7.5.2. Смесь ацетонитрил:вода (объемное соотношение 2:8). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 20 куб. см ацетонитрила и 80 куб. см воды, перемешивают. 7.5.3. Смесь ацетонитрил:вода (объемное соотношение 3:7). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 30 куб. см ацетонитрила и 70 куб. см воды, перемешивают. 7.5.4. Смесь ацетонитрил:вода (объемное соотношение 1:1). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 50 куб. см ацетонитрила и 50 куб. см воды, перемешивают. ### 7.6. Приготовление растворов внесения 7.6.1. Исходный раствор дифеноконазола для внесения (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г дифеноконазола, растворяют в 50 - 70 куб. см ацетона, доводят им до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3 месяцев. 7.6.2. Раствор N 1 дифеноконазола для внесения (концентрация 5 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 5,0 куб. см исходного раствора дифеноконазола для внесения с концентрацией 100 мкг/куб. см [(п. 7.6.1)](#p100148), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца. ### 7.7. Подготовка колонки с силикагелем Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию - 4 г силикагеля в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 15 куб. см смеси гексан:ацетон в объемном соотношении 9:1, скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе. ### 7.8. Подготовка концентрирующего патрона Sep Pak Classik C18 для очистки экстрактов Концентрирующий патрон Sep Pak Classik C18 промывают последовательно с помощью медицинского шприца 5 куб. см метанола и 10 куб. см воды со скоростью 5 куб. см/мин. Нельзя допускать высыхания поверхности патрона. ### 7.9. Проверка хроматографического поведения дифеноконазола на колонке с силикагелем В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2,0 куб. см раствора N 5 дифеноконазола для градуировки с концентрацией 0,25 мкг/куб. см [(п. 7.2.3)](#p100129), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан:ацетон (8:2 по объему), помещая на ультразвуковую баню на 40 - 60 с, и наносят на колонку, подготовленную по [п. 7.7](#p100151). Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей, порциями по 5 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 20 куб. см смеси гексан:ацетон в объемном соотношении 9:1, элюат отбрасывают. Затем колонку промывают 70 куб. см смеси гексан:ацетон (7:3 по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см смеси гексан:ацетон (8:2 по объему), анализируют содержание дифеноконазола по [п. 9.5](#p100190). Фракции, содержащие дифеноконазол, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента. *Примечание.* Проверку хроматографического поведения дифеноконазола следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей. ### 7.10. Проверка поведения дифеноконазола на концентрирующем патроне Sep Pak Classik C18 В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2,0 куб. см раствора N 5 дифеноконазола для градуировки с концентрацией 0,25 мкг/куб. см [(п. 7.2.3)](#p100129), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая на ультразвуковую баню на 40 - 60 с, затем добавляют 9,0 куб. см деионизованной воды, перемешивают и наносят на подготовленный концентрирующий патрон Sep Pak Classik C18 [(п. 7.8)](#p100153). Патрон промывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода (1:9 по объему), 10 куб. см смеси ацетонитрил:вода (2:8 по объему), 10 куб. см смеси ацетонитрил:вода (объемное соотношение 3:7), элюаты отбрасывают. Дифеноконазол элюируют с патрона 20 куб. см смеси ацетонитрил:вода (1:1 по объему), отбирая фракционно (по 5 куб. см), элюат упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см смеси гексан:ацетон (8:2 по объему), анализируют содержание дифеноконазола по [п. 9.5](#p100190). Фракции, содержащие дифеноконазол, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюента. ## 8. Отбор и хранение проб Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ: [ГОСТ 4427-82](https://bukva.ai/docs/gost-4427-82) "Апельсины. Технические условия"; [ГОСТ 4428-82](https://bukva.ai/docs/gost-4428-82) "Мандарины. Технические условия"; [ГОСТ 4492-82](https://bukva.ai/docs/gost-4429-82) "Лимоны. Технические условия"; [ГОСТ 26313-84](https://bukva.ai/docs/standart-gost-26313-84) "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб"; [ГОСТ 6293-90](https://bukva.ai/docs/gost-6293-90) "Рис. Требования при заготовках и поставках", и "Унифицированными [правилами](https://bukva.ai/docs/2051-79) отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отобранные пробы цитрусовых и бананов хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 1 недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C. Рис подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в тканевых мешочках в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более месяца. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C. Пробы сока цитрусовых анализируют в день изготовления. Перед анализом образцы измельчают с помощью гомогенизатора. ## 9. Выполнение определения ### 9.1. Экстракция ##### 9.1.1 Бананы, цитрусовые (мякоть и сок) Измельченные образцы исследуемых продуктов массой 25 г вносят в коническую колбу на 250 - 300 куб. см, добавляют 100 куб. см ацетона, интенсивно встряхивают вручную в течение 3 мин. и помещают на аппарат для встряхивания на 40 мин., затем в течение 3 мин. выдерживают на ультразвуковой бане. Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр "красная лента". В коническую колбу с пробой вносят новые порции экстрагента объемом 50 куб. см и повторно экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 20 мин., затем на ультразвуковой бане в течение 1 мин., после чего раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Фильтр промывают ацетоном, порцией 30 куб. см. Экстракт и промывную жидкость помещают в мерный цилиндр на 250 куб. см, отбирают 1/5 экстракта (эквивалентную 5 г образца), переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см и добавляют 30 куб. см деионизованной воды. Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C до водного остатка. Далее проводят очистку экстракта по [п. 9.2](#p100181). ##### 9.1.2 Зерно риса Измельченные образцы риса массой 25 г вносят в коническую колбу на 250 - 300 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон:вода (8:2 по объему), после встряхивания вручную в течение 3 мин. помещают на аппарат для встряхивания на 40 мин., затем в течение 3 мин. выдерживают на ультразвуковой бане. Пробам дают отстояться, надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр "красная лента". В коническую колбу с пробой вносят новые порции экстрагента объемом 50 куб. см и повторно экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 20 мин., затем на ультразвуковой бане в течение 1 мин., после чего раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Фильтр промывают ацетоном порцией 30 куб. см. Экстракт и промывную жидкость помещают в мерный цилиндр на 250 куб. см, отбирают 1/5 экстракта (эквивалентную 5 г образца), переносят в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см и добавляют 30 куб. см деионизованной воды. Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C до водного остатка. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2. ### 9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей Водный остаток, полученный по [пп. 9.1.1](#p100173) или [9.1.2](#p100177), переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Колбу ополаскивают 10 куб. см деионизованной воды, которую также переносят в делительную воронку. Вносят в воронку 15 куб. см насыщенного водного раствора хлористого натрия и 30 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (объемное соотношение 4:1). Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 2 - 3 мин. После полного разделения слоев верхний органический слой (гексан-диэтиловый эфир) фильтруют через слой безводного сульфата натрия в колбу для упаривания вместимостью 100 куб. см. Водную фракцию возвращают и дважды повторяют экстракцию новыми порциями по 25 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (4:1 по объему). Объединенный органический экстракт, пропущенный через безводный сульфат натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C. Сухой остаток подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем по п. 9.3. ### 9.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем Сухой остаток, полученный по [п. 9.2](#p100181), находящийся в колбе для упаривания, растворяют в 5,0 куб. см смеси гексан - ацетон (95:5 по объему), наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по [п. 7.6](#p100147). Колбу ополаскивают дважды порциями смеси гексан - ацетон по 2,5 куб. см, которую наносят на колонку, скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 20 куб. см смеси гексан - ацетон в объемном соотношении 9:1, элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют с колонки 70 куб. см смеси гексан - этилацетат в объемном соотношении 7:3 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C. При анализе проб бананов сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2 по объему), помещают в ультразвуковую баню на 40 - 60 с и анализируют содержание дифеноконазола методом ГЖХ по [п. 9.5](#p100190). Пробы зерна риса, цитрусовых (мякоть и сок) подвергают дополнительной очистке на концентрирующем патроне Sep Pak Classik по п. 9.4. ### 9.4. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Sep Pak Classik C18 (зерно риса, цитрусовые (мякоть и сок)) Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по [п. 9.3](#p100184), растворяют с помощью ультразвуковой бани в 1 куб. см ацетонитрила, затем добавляют 9,0 куб. см деионизованной воды, перемешивают и переносят на подготовленный концентрирующий патрон Sep Pak Classik C18 [(п. 7.8)](#p100153). Патрон промывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода (1:9 по объему), 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода (2:8 по объему), 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода (объемное соотношение 3:7), элюаты отбрасывают. Дифеноконазол элюируют 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода (1:1 по объему) в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 25 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан - ацетон (8:2 по объему) и анализируют содержание дифеноконазола по п. 9.5. ### 9.5. Условия хроматографирования Газовый хроматограф, снабженный электронно-захватным детектором. Колонка капиллярная НР-35 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм. Температура: детектора - 320 °C, испарителя - 290 °C. Температура термостата колонки программированная. Начальная температура 230 °C, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 260 °C, выдержка 2 мин., нагрев колонки со скоростью 15 °/мин. до температуры 295 °C. Газ 1 (азот): давление 100 кПа, 40,27 см/с, поток 1,782 куб. см/мин. Газ 2 (азот): деление потока 1:3; сброс 6,9 куб. см/мин. Хроматографируемый объем: 1 куб. мм. Ориентировочное время выхода дифеноконазола: 17 мин. 46 с - 17 мин. 50 с. Линейный диапазон детектирования: 0,025 - 0,25 нг. Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,25 мкг/куб. см, разбавляют смесью гексан - ацетон (8:2 по объему), не более чем в 50 раз. ## 10. Обработка результатов анализа
Содержание дифеноконазола в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:
C х V X = -----, m где: C - концентрация дифеноконазола, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см; V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m - объем (масса) анализируемого образца, куб. см (г).
## 11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1): $\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq r,(1)$ где: X , X - результаты параллельных определений, мг/кг; 1 2 r - значение предела повторяемости [(табл. 1)](#p100029), при этом $r = 2,8\sigma_{r}$ . При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ. ## 12. Оформление результатов Результат анализа представляют в виде: $(\overline{X}±\Delta),\text{мг}/\text{кг},\text{при вероятности }P = 0,95,$ где $\overline{X}$ - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг; $\Delta$ - граница абсолютной погрешности, мг/кг; $\Delta = \frac{\delta \times X}{100} ,$ где $\delta$ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, [табл. 1](#p100029)), %. Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание дифеноконазола в пробах бананов, зерна риса, цитрусовых (мякоть и сок) менее - 0,01 мг/кг <*>". --- <*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения дифеноконазола в пробах бананов, зерна риса, цитрусовых (мякоть и сок) соответственно. ## 13. Контроль качества результатов измерений Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с [ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-4-2002) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений". ### 13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов. При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание дифеноконазола в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,025 до 0,25 мкг/куб. см. Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
$A = \frac{(X - C) \times 100}{C} \leq 10,$
где: X - концентрация дифеноконазола в пробе при контрольном измерении, мкг/куб. см; C - известная концентрация градуировочного раствора дифеноконазола, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/куб. см; 10 - погрешность градуировочной характеристики, %. Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов дифеноконазола, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно [п. 7.3](#p100132). Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. ### 13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок. Величина добавки C должна удовлетворять условию:
д
$\text{С}_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime},$ где: $\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime})$ - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом: $\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta,$ где $\Delta$ - граница абсолютной погрешности, мг/кг. $\Delta = \frac{\delta \times X}{100} ,$ где $\delta$ - граница относительной погрешности методики (показатель точности, [табл. 1](#p100029)), %. Контрольный параметр процедуры К рассчитывают по формуле: к $\text{К}_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - \text{С}_{\text{д}},$ где $\overline{X}\prime,\overline{X},\text{С}_{\text{д}}$ - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по [п. 11](#p100208)) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг. Норматив контроля К рассчитывают по формуле: $\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} .$ Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом к контроля (К). Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию: $|\text{К}_{\text{к}}| \leq \text{К},(2)$ процедуру анализа признают удовлетворительной. При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению. ### 13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R): $\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{X_{1} + X_{2}} \leq r,(3)$ где: X , X - результаты измерений, выполненных в условиях, 1 2 воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг; R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, [табл. 1](#p100029)), %. ---