МУК 4.1.2989-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ципродинила в томатах методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 19.03.2012)
Примечание
Документ введен в действие с 19 марта 2012 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
19 марта 2012 года
с момента утверждения
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЦИПРОДИНИЛА В ТОМАТАХ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2989-12
Свидетельство о метрологической аттестации от 16.08.2011 № 0094.02.08.11.
Введение
Ципродинил — системный фунгицид из класса анилинопиримидинов. Эффективен против возбудителей парши, альтернариоза, мучнистой росы, кластероспориоза, коккомикоза, плодовой гнили, монилиального ожога на зерновых злаках, винограде, семечковых и косточковых культурах, землянике, овощных и декоративных культурах. Подавляет рост мицелия различных патогенов, в том числе устойчивых к фунгицидам из групп триазолов, карбаматов, имидазолов, стробилуринов и др. Хорошо проникает в растения через листья и передвигается преимущественно по ксилеме.
Применяется в России в качестве фунгицида для борьбы с болезнями семечковых и косточковых плодовых культур при норме расхода от 150 до 260 г д.в./га и двукратной обработке за сезон.
1. Общие положения
Настоящий документ устанавливает процедуру измерений массовой концентрации ципродинила в томатах в диапазоне 0,5 — 5,0 мг/кг методом капиллярной газожидкостной хроматографии.
Название вещества по ИСО: ципродинил.
Название вещества по ИЮПАК: 4-циклопропил-6-метил-N-фенил-пиримидин-2-амин.
Эмпирическая формула: C_{14}H_{15}N_{3} .
Кремовое кристаллическое вещество со слабым запахом. Температура плавления: 75,9 °C. Давление паров при 25 °C: 5,1 \times 10^{- 1}\text{Па} (модификация A) и 4,7 \times 10^{- 1}\text{Па} (модификация B). Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_{OW}logP = 3,9(pH5),4,0(pH7\text{и }9) . Растворимость (г/дм3) при 25 °C: ацетон — 610, толуол — 460, этанол — 160, гексан — 30, вода — 0,02 (pH 5). Величина pK_{a}4,44 .
Вещество устойчиво к гидролизу ( DT_{50}>1\text{года} при pH 4 — 9), фотолитически быстро разрушается в воде (DT_{50} = 0,4 - 13,5\text{дней}) .
В биологически активных почвах в аэробных условиях ципродинил достаточно быстро исчезает, переходя главным образом в прочносвязанное состояние: DT_{50} = 20 - 60\text{дней} .
MRL ципродинила в томатах, установленный в странах ЕС, составляет 1,0 мг/кг.
2. Метрологические характеристики метода
При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности) +/- дельта, % | Стандартное отклонение повторяемости сигма , % r | Предел повторяемости r , % | Предел воспроизводимости, R, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Томаты | от 0,5 до 5,0 мг/кг вкл. | 25 | 1,5 | 4 | 6 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
| Анализируемый | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| объект | предел обнаружения, мг/кг | диапазон определяемых концентраций, мг/кг | полнота извлечения вещества, % | стандартное отклонение S, % | доверительный интервал среднего +/-, % |
| Томаты | 0,5 | 0,5 — 5,0 | 90,4 | 3,1 | 1,45 |
3. Метод измерений
Методика основана на экстракции ципродинила из томатов ацетоном, очистке экстракта, содержащего фунгицид, от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей с последующим измерением содержания ципродинила в очищенном экстракте методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) при программировании температуры с термоионным детектором (ТИД) и обработкой хроматограмм методом абсолютной калибровки. Идентификация вещества проводится по времени удерживания.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.
устройства, реактивы и материалы <*>
<*> Допускается применение средств измерений, вспомогательных устройств, материалов и реактивов иных производителей с аналогичными техническими и метрологическими характеристиками, приведенными в разделе 4.
4.1 Средства измерений
Газовый хроматограф Varian CP-3800 с ТИД (США) (номер Госреестра 16499-06)
Весы лабораторные аналитические Sartorius 6110 2-го класса точности (ГОСТ 24104-2001), погрешность взвешивания 0,0001 г
Весы лабораторные Metler P-160 2-го класса точности (ГОСТ 24104-2001), погрешность взвешивания 0,005 г
Колбы мерные вместимостью 2-50-2, 2-100-2, 2-1000-2 ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные 1-1-2-1; 1-1-2-2; 1-2-2-5; 1-2-2-10 ГОСТ 29227-91
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой П-2-5-0,1; П-2-10-0,2 ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные 1-25; 1-50; 1-100; 1-500; 1-1000 ГОСТ 1770-74
4.2 Реактивы
Ципродинил (CAS 121552-61-2) с содержанием основного вещества не менее 99,9%, аналитический стандарт (Сингента, Швейцария)
Ацетон квалификации чда ГОСТ 2603-79
Вода дистиллированная или деионизованная ГОСТ 6709-72
Гелий газообразный очищенный марки "A" ТУ 0271-135-31323949-05 н-Гексан квалификации хч ТУ 6-09-3375-78
Калий углекислый квалификации хч ГОСТ 4221-76
Калия перманганат квалификации хч ГОСТ 20490-75
Кальций хлористый квалификации ч ТУ 6-09-4711-81
Кислота серная квалификации хч ГОСТ 4204-77
Натрий углекислый квалификации хч ГОСТ 83-79
Натрия сульфат безводный квалификации хч ГОСТ 4166-76
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) квалификации ч ГОСТ 22300-76
4.3 Вспомогательные устройства, материалы
Ванна ультразвуковая, модель D-50, фирма Branson Instr. Co. (США)
Гомогенизатор «Omni-mixer» (Sorvall, США) или гомогенизатор МРТУ 42-1505
Генератор водорода, мод. SPE (фирма General Electric, США) или аналогичный
Дистиллятор Cyclon III, мод. 4 BD (Fistreem, Великобритания)
Компрессор (СКВ «Хроматэк», Россия)
Установка Elgastat B 114 с патроном Elgacan B 114 для получения деионизованной воды (Elga, Великобритания)
Воронки делительные вместимостью 100 см3 ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные стеклянные ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100 см3 ГОСТ 9737-93
Колбы плоскодонные вместимостью 250 см3 ГОСТ 9737-93
Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая VF-5ms (типа SE-52), длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, фирма «Varian» (США) или аналогичная
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi (Швейцария) ТУ 25-11-917-76
Стаканы химические вместимостью 100 и 500 см3 ГОСТ 25336-82
Установка для перегонки растворителей с дефлегматором ГОСТ 9737-93 (ИСО 641-75)
Фильтры бумажные «красная лента» обеззоленные ТУ 6-09-2678-77
5. Требования безопасности
5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.
5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91, и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.
5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019-2009 и инструкцией по эксплуатации прибора.
5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.
6. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.
7. Требования к условиям измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия.
7.1 Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу
Температура воздуха (20 +/- 5) °C Атмосферное давление (84 - 106) кПа Относительная влажность воздуха не более 80%
7.2 Условия хроматографического анализа
Температура термостата испарителя 260 °C Температура термостата детектора 280 °C
Режим программирования температуры колонки:
- начальная температура 170 °C
- изотермический режим при 170 °C 2 мин
- скорость подъема температуры в диапазоне от 170 до 220 °C 20 °C/мин
- изотермический режим при 220 °C 0 мин
- скорость подъема температуры в диапазоне от 220 до 240 °C 5 °C/мин
- изотермический режим при 240 °C 3 мин
- скорость подъема температуры в диапазоне от 240 до 280 °C 20 °C/мин
- изотермический режим при 280 °C 5 мин
Объем вводимой пробы 1 мм3 Время удерживания ципродинила (8,82 +/- 0,2) мин Линейный диапазон детектирования (0,1 - 1,0) нг
8. Подготовка к выполнению измерений
Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.
8.1 Очистка органических растворителей
8.1.1 Очистка н-гексана
Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом. Срок хранения — 1 неделя.
8.1.2 Очистка ацетона
Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 дм3 ацетона 10 г KMnO_{4} и 2 г K_{2}CO_{3} ). Срок хранения — 1 неделя.
8.1.3 Очистка этилацетата
Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%.
Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого в конической колбе растворяют в (40 — 60) см3 дистиллированной воды. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Срок хранения раствора — 1 неделя.
Этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют. Срок хранения — 1 неделя.
8.2 Подготовка и кондиционирование хроматографической колонки
Капиллярную кварцевую колонку VF-5ms (типа SE-52) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °C и скорости газа-носителя 2 см3/мин в течение 8 — 10 ч.
8.3 Приготовление градуировочных растворов
8.3.1. Исходный градуировочный раствор ципродинила с массовой концентрацией 200 мкг/см3. В мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают (0,010 +/- 0,0001) г ципродинила, растворяют в 20 — 30 см3 этилацетата, доводят объем раствора этим же растворителем до метки, тщательно перемешивают.
Раствор хранят при температуре не выше минус 18 °C в течение 3 месяцев.
8.3.2. Градуировочный раствор ципродинила с массовой концентрацией 10 мкг/см3 (раствор № 1). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 5 см3 исходного градуировочного раствора ципродинила с концентрацией 200 мкг/см3 (п. 8.3.1), разбавляют смесью гексан — этилацетат (8:2, по объему) до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов № 2 — 5.
При оценке полноты извлечения ципродинила для внесения в образцы используют ацетоновые растворы вещества с концентрациями 10 и 50 мкг/см3.
Градуировочный раствор № 1 и ацетоновые растворы ципродинила хранят при температуре не выше минус 18 °C в течение месяца.
8.3.3. Градуированный раствор ципродинила с массовой концентрацией (0,1 — 1,0) мкг/см3 (растворы № 2 — 5). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают 1, 2, 5 и 10 см3 градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/см3 (п. 8.3.2), доводят объем раствора до метки смесью гексан — этилацетат (8:2, по объему), тщательно перемешивают, получают градуировочные растворы № 2 — 5 с массовой концентрацией ципродинила 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см3 соответственно.
Растворы готовят непосредственно перед использованием.
8.4 Градуировка хроматографа
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мкВ) от концентрации ципродинила в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 градуировочным растворам (п. 8.3.3).
В инжектор хроматографа вводят по 1 мм3 каждого градуировочного раствора (п. 8.3.3) и анализируют при условиях хроматографирования по п. 7.2. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r. По полученным данным строят градуировочную характеристику.
Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерения по анализу одного из градуировочных растворов. Если значение площади отличается более чем на 10% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.
9. Отбор, хранение и подготовка проб
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79) и правилами, определенными ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие. Требования при заготовках и поставках».
Образцы томатов хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более суток; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C. Перед проведением анализа плоды измельчают.
9.1 Экстракция и очистка
Навеску измельченного растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 см3, добавляют 100 см3 ацетона и гомогенизируют 3 мин при 10000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена. Осадок на фильтре промывают 50 см3 ацетона. Экстракт и промывную жидкость объединяют в мерном цилиндре, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/25 объема экстракта (эквивалентную 1 г образца), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 см3 и добавляют 30 см3 дистиллированной воды. Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C до водной фазы объемом 15 — 20 см3. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 см3, круглодонную колбу обмывают 10 см3 дистиллированной воды, которые также вносят в воронку. В воронку приливают 30 см3 смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему) и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 см3. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 20 см3 смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток экстракта томатов растворяют в 5 см3 смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и анализируют на содержание ципродинила по п. 10.
10. Выполнение измерений
10.1. В испаритель хроматографа вводят по 1 мм3 очищенного экстракта анализируемой пробы (п. 9.1), анализируют при условиях п. 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.
10.2. Для каждого образца томатов повторяют операции по пп. 9.1 и 10.1.
11. Обработка результатов измерений
Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации «Galaxie», версия 1.9.3.2.
Альтернативная обработка результатов
Содержание ципродинила рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
X = \frac{H_{1} \cdot A \cdot V}{H_{0} \cdot m} ,
где X — содержание ципродинила в пробе, мг/кг;
H_{1} — площадь пика образца, мкВ;
H_{0} — площадь пика стандарта, мкВ;
A — концентрация стандартного раствора ципродинила, мкг/см3;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки и последующего хроматографического определения, г.
12. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , (1)
где X_{1} , X_{2} — результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8\sigma_{r} .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
13. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг, при вероятности P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае, если полученный результат измерений ниже нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,5 мг/кг» <*>.
<*> 0,5 мг/кг — предел обнаружения ципродинила в анализируемом объекте.
14. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
14.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
14.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки C_{\text{д}} должна удовлетворять условию:
C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime} ,
где \pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta ,
где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры K_{\text{к}} рассчитывают по формуле:
K_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - C_{\text{д}} ,
где \overline{X}\prime , \overline{X} , C_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле:
K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} .
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_{\text{к}}) с нормативом контроля (K).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
14.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , (3)
где X_{1} , X_{2} — результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
15. Разработчики
Дубовая Л.В., Талалакина Т.Н., Макеев А.М. (ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии Россельхозакадемии).
Полнота определения ципродинила в модельной матрице (n = 5)
| Матрица | Внесено ципродинила, мг/кг | Открыто ципродинила, % | Стандартное отклонение S, % | Доверительный интервал среднего результата +/-, % |
|---|---|---|---|---|
| Томаты | 0,5 1,0 2,5 5,0 | 87,6 88,9 90,8 94,1 | 1,41 1,84 1,70 1,20 | 1,76 2,28 2,12 1,50 |