МУК 4.1.2987-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств тиаклоприда в зеленой массе, семенах и масле рапса, ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 19.03.2012)
Примечание
Документ введен в действие с 19 марта 2012 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
19 марта 2012 года
с момента утверждения
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТИАКЛОПРИДА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ РАПСА, ЯГОДАХ И СОКЕ ВИНОГРАДА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2987-12
1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22.12.2012 № 2).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 19 марта 2012 г.
3. Введены в действие с момента утверждения.
Свидетельство о метрологической аттестации от 11.10.2011 № 01.5.04.034/01.00043/2011.
Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств тиаклоприда в ягодах и соке винограда, зеленой массе, семенах и масле рапса в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг.
Название действующего вещества по ИСО: тиаклоприд.
Название действующего вещества по ИЮПАК: (Z)-3-(6-хлор-3-пиридилметил)-1,3-тиазолидин-2-илиденцианамид.
Химически чистое вещество представляет собой желтоватый кристаллический порошок.
Температура плавления: > 270 °C разлагается.
Давление пара: 3 \times 10^{- 7}\text{м}Pa (20 °C).
Растворимость в воде (мг/дм3, 20 °C): 185.
Краткая токсикологическая характеристика
Острая оральная токсичность (крысы) LD_{50} 836 и 444 мг/кг для особей мужского и женского пола соответственно. Острая дермальная токсичность (крысы) LD_{50} более 2000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на глаза и кожу (кролики). Ингаляционная токсичность (крысы) более 2535 и 1223 мг/м3 соответственно для особей мужского и женского пола. Период наблюдения 4 ч. Не обладает канцерогенным, генотоксичным и мутагенным действием.
Инсектицид, используется для обработки листьев яблонь, косточковых фруктовых деревьев, ягод, хлопка, овощей, сахарной свеклы, картофеля, риса и декоративных растений против сосущих и кусающих насекомых, включая смородинную тлю, белокрылку и жужелицу.
В России для тиаклоприда установлены следующие гигиенические нормативы:
ДСД — 0,005 мг/кг массы человека;
ПДК в воде водоемов — 0,004 мг/дм3;
МДУ — в винограде — 0,02 мг/кг, в плодовых семечковых, семенах и масле рапса — 0,3 мг/кг (данные нормативы вступают в силу после внесения изменений в единые санитарно-гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому контролю в рамках соглашения Таможенного союза по санитарным мерам).
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
Полнота извлечения тиаклоприда, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата
для n = 20, P = 0,95
2. Метод измерения
Методика основана на определении тиаклоприда методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции смесью ацетона и воды и очисткой проб перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на концентрирующем патроне, заполненном силикагелем.
Идентификация тиаклоприда проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1 Средства измерений
| Жидкостный хроматограф «Alliance» фирмы «Waters» с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки | |
|---|---|
| Весы аналитические ВЛА-200 | ГОСТ 24104-01 |
| Весы технические ВЛКТ-500 | ГОСТ 24104-01 |
| Колбы мерные на 10, 100 и 1000 см3 | ГОСТ 23932-90 |
| Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 мм3 и от 1 до 5 см3 | ТУ 9452-002-33189998-02 |
| Пипетки градуированные | ГОСТ 29227-91 |
| Цилиндры мерные на 50 и 100 см3 | ГОСТ 23932-90 |
Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными характеристиками.
3.2 Реактивы
| Тиаклоприд с содержанием основного вещества 99,7% (Cheminova A/S) | |
|---|---|
| Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ» или хч | ТУ 6-09-3534-87 |
| Ацетон, ОП-2 ОСЧ 9-5 | ТУ 2633-039-4449317 |
| Вода бидистиллированная, деионизированная | ГОСТ 6709-79 |
| Гексан, хч | ТУ 2631-003-05807999-98 |
| Метилен хлористый, хч | ТУ 2631-019-44493179-98 с изм. 1, 2, 3 |
| Натрий гидроокись, хч | ГОСТ 4238-77 |
| Сульфат натрия безводный, хч | ГОСТ 4166-76 |
| Хлорид натрия, чда | ГОСТ 4233-77 |
| Этилацетат, хч, ОКП 26 3471 5023 09 | ГОСТ 22300-76 |
Примечание. Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанной.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
4. Требования безопасности
4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.
При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны».
5. Требования к квалификации операторов
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
6. Условия измерений
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%:
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к определению
7.1 Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку (SunFire C18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.
7.2 Приготовление растворов
7.2.1. Приготовление 0,005%-го раствора ортофосфорной кислоты: в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают (0,5 + 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Перемешивают.
7.2.2. Приготовление 2 М раствора хлорида натрия: в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают 117 г хлорида натрия. Растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Перемешивают.
7.2.3. Приготовление 0,01 М раствора гидроксида натрия: в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают 0,4 г гидроксида натрия. Растворяют в 0,5 дм3 бидистиллированной воды и доводят объем до метки. Перемешивают.
7.2.4. Для приготовления подвижной фазы: смешивают ацетонитрил и 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70 по объему, используя мерные цилиндры.
7.2.5 Приготовление элюентов для твердофазной экстракции.
Элюент 1. В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 25 см3 гексана и доводят объем до метки этилацетатом. Перемешивают. Элюент хранят в вытяжном шкафу и используют свежеприготовленным.
Элюент 2. В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10 см3 гексана и доводят объем до метки этилацетатом. Перемешивают. Элюент хранят в вытяжном шкафу и используют свежеприготовленным.
7.3 Приготовление основного и градуировочных растворов
7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску тиаклоприда (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.
Градуировочные растворы тиаклоприда с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 0,75 и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему основного раствора подвижной фазы.
7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией тиаклоприда 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией тиаклоприда 0,75 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 7,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией тиаклоприда 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 5,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.5. Раствор № 4 с концентрацией тиаклоприда 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 2,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.6. Раствор № 5 с концентрацией тиаклоприда 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 1,0 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение месяца, градуировочные растворы — в течение недели.
При изучении полноты определения тиаклоприда в ягодах и соке винограда, зеленой массе, семенах и масле рапса используют ацетонитрильные растворы тиаклоприда. Растворы с концентрациями 1,0 и 10,0 мкг/см3 готовят из основного раствора с концентрацией 0,5 мг/см3 методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.
7.4 Построение градуировочного графика
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация тиаклоприда в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации тиаклоприда в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
C — аттестованное значение массовой концентрации тиаклоприда в градуировочном растворе;
C_{\text{к}} — результат контрольного измерения массовой концентрации тиаклоприда в градуировочном растворе;
\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).
7.5 Подготовка концентрирующих патронов Силикагель 60
Непосредственно перед употреблением через патрон пропускают 2 см3 элюата 1.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.1979 № 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».
Отбор проб винограда производят в соответствии с ГОСТ 25896-83 «Виноград свежий столовый. Технические условия». Пробы ягод винограда хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 6 месяцев. Пробы виноградного сока хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение недели.
Для исследовательских целей допускается получение в лаборатории масла из проб измельченных семян рапса методом экстракции органическим растворителем при температуре не выше 40 °C. Пробы масла хранят в холодильнике при 4 °C в закрытой стеклянной таре не более 30 суток.
9. Проведение определения
9.1 Определение тиаклоприда в соке винограда
На воронке Бюхнера фильтруют 20 см3 сока и доводят объем фильтрата до 100 см3 водой. Полученный раствор помещают в делительную воронку вместимостью 250 см3 и промывают двумя порциями гексана по 25 см3. Органический слой отделяют и отбрасывают. К водному остатку прибавляют 50 см3 2 М раствора хлорида натрия и экстрагируют тиаклоприд 25 см3 хлористого метилена, встряхивая воронку в течение 2 мин. Отделяют нижний органический слой и дважды повторяют экстракцию. Объединенный экстракт промывают 20 см3 0,01 М раствора гидроксида натрия, водный слой отделяют и отбрасывают, а органический пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1,5 см3 этилацетата, прибавляют 0,5 см3 гексана и количественно переносят пробу в подготовленный концентрирующий патрон Силикагель 60. Промывают 8 см3 элюента 1. Промывку отбрасывают. Тиаклоприд элюируют 10 см3 элюента 2. Элюат упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 20 мм3 полученного раствора вводят в хроматограф.
9.2 Определение тиаклоприда в ягодах винограда
В коническую колбу вместимостью 250 см3 помещают 20 г измельченных ягод, прибавляют 10 см3 воды, 40 см3 ацетона и экстрагируют в течение 10 мин в ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят водой до 100 см3 и далее обрабатывают пробу по п. 9.1.
9.3 Определение тиаклоприда в масле рапса
В коническую колбу вместимостью 250 см3 помещают 20 г масла и прибавляют 80 см3 гексана. Раствор перемешивают и переносят в делительную воронку. Тиаклоприд экстрагируют тремя порциями по 25 см3 смеси ацетонитрил-вода в объемном соотношении 4:1. Экстракты (нижний слой) объединяют и промывают в делительной воронке двумя порциями по 25 см3 гексана. Промывку отбрасывают. Водноацетонитрильный раствор упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани 40 °C до полного удаления ацетонитрила. Объем водного остатка доводят водой до 100 см3 и далее пробу обрабатывают по п. 9.1.
9.4 Определение тиаклоприда в зеленой массе и семенах рапса
В коническую колбу вместимостью 250 см3 помещают 20 г измельченной зеленой массы или семян рапса, прибавляют 10 см3 воды и 40 см3 ацетона и экстрагируют в течение 15 мин при температуре 30 °C. Суспензию фильтруют и повторяют экстракцию. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят водой до 100 см3 и далее обрабатывают пробу по п. 9.1.
9.5 Условия хроматографирования
Жидкостный хроматограф «Alliance» фирмы Waters с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка SunFire C18 (4,6 x 250) мм, 5 мкм (Waters).
Температура колонки: (30 +/- 1) °C.
Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70.
Время удерживания тиаклоприда: (11,0 +/- 0,2) мин.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,2 — 2,0 мкг/см3.
10. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание тиаклоприда в ягодах и соке винограда, зеленой массе, семенах и масле рапса (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
X = \frac{S_{x} \cdot K \cdot V \cdot 100}{P \cdot f} , где
K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;
V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;
P — навеска анализируемого образца, г;
f — полнота извлечения тиаклоприда, приведенная в табл. 2, %.
Содержание остаточных количеств тиаклоприда в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор тиаклоприда с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)
X_{1} и X_{2} — результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
(X \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где
X — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае, если содержание определяемого компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание тиаклоприда в пробах ягод и сока винограда, зеленой массе, семенах и масле рапса менее 0,01 мг/кг» <*>.
<*> — 0,01 мг/кг — предел обнаружения тиаклоприда в пробах ягод и сока винограда, зеленой массе, семенах и масле рапса.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки C_{\text{д}} должна удовлетворять условию:
\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X'}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом
\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где
\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где
\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры K_{\text{к}} рассчитывают по формуле:
X', X, C_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле:
K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}}
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_{\text{к}}) с нормативом контроля (K).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):
X_{1} и X_{2} — результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.
14. Разработчики
Долженко В.И., Цибульская И.А., Журкович И.К., Луговкина Н.В., Ковров Н.Г. (ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Россельхозакадемии», Санкт-Петербург).