МУК 4.1.2920-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений остаточного содержания флуоксастробина в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 12.07.2011)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 12 июля 2011 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
12 июля 2011 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ ОСТАТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ ФЛУОКСАСТРОБИНА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
с момента утверждения
1. Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 июля 2011 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Введение
Флуоксастробин — системный синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Механизм его действия связан с подавлением дыхания, приводящего к прекращению прорастания спор и роста мицелия. Вещество обладает защитным и искореняющим действием. При обработке вегетирующих растений в дозах до 200 г/га оно эффективно подавляет развитие возбудителей ржавчины, септориоза, мучнистой росы, ломкости стеблей и пятнистости листьев на посевах ячменя, пшеницы и других культур, а при протравливании семян зерновых колосовых культур в дозах 50 — 100 г/т защищает последние от заражения твердой и пыльной головней и фузариозной корневой гнилью.
1. Общие положения
Свидетельство о метрологической аттестации от 27.01.2011 № 01.00225/6-11.
Настоящий документ устанавливает процедуру измерений массовой концентрации флуоксастробина в воде в диапазоне 0,001 — 0,010 мг/куб. дм, массовой доли в почве и зерне в диапазоне 0,01 — 0,10 мг/кг, в соломе в диапазоне 0,05 — 0,50 мг/кг методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Название вещества по ИСО: флуоксастробин.
Название вещества по ИЮПАК: (1E)-{2-[6-(2-хлорфенокси)-5-фторпиримидин-4-илокси]фенил}(5,6-дигидро-1,4,2-диоксазин-3-ил)метанон O-метилоксим.
Структурная формула (не приводится).
C H ClFN O . 21 16 4 5
Белое кристаллическое вещество со слабым запахом, состоит из двух оптических изомеров E и Z. Температура плавления: 103 - 108 °C. Давление
-7
паров при 20 °C: 6 х 10 мПа. Коэффициент распределения в системе н-октанол/вода при 20 °C: K log P = 2,86. Растворимость (г/куб. дм) при
ow
20 °C: н-гептан — 0,04; 2-пропанол — 6,7; ксилол — 38,1; ацетон, ацетонитрил, дихлорметан, этилацетат — все более 250; вода — 0,0023.
Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой и щелочной средах (DT => 1 года). 50
В присутствии света в водных фотолитических условиях флуоксастробин достаточно быстро деградирует с периодом полураспада 4,1 дня.
В биологически активных почвах в аэробных условиях флуоксастробин разрушается достаточно медленно: показатель DT варьирует от нескольких
50
дней до нескольких недель.
2. Метрологические характеристики
При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.
| Анализируемый объект | Диапазон измерений содержания флуоксастробина, -1 млн. (мг/кг) | Показатель точности (границы относительной погрешности), +/- дельта, %, при P = 0,95 | Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), сигма , % r | Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), сигма , % R | Предел повторяемости, r, %, P = 0,95, n = 2 | Критическая разность для результатов анализа, полученных в двух лабораториях, CD , % 0,95 (n = n = 2) 1 2 | |
| Eизомер | Вода | От 0,0010 до 0,005 вкл. (мг/куб. дм) | 60 | 17 | 26 | 47 | 64 |
| Св. 0,005 до 0,010 вкл. (мг/куб. дм) | 40 | 12 | 18 | 33 | 44 | ||
| Почва | От 0,010 до 0,05 вкл. | 75 | 15 | 22 | 42 | 53 | |
| Св. 0,05 до 0,10 вкл. | 55 | 10 | 16 | 28 | 40 | ||
| Зерна | От 0,010 до 0,05 вкл. | 80 | 18 | 27 | 50 | 66 | |
| Св. 0,05 до 0,10 вкл. | 45 | 12 | 18 | 33 | 44 | ||
| Солома | От 0,05 до 0,10 вкл. | 85 | 17 | 26 | 47 | 64 | |
| Св. 0,10 до 0,5 вкл. | 55 | 10 | 15 | 28 | 37 | ||
| Zизомер | Вода | От 0,0010 до 0,005 вкл. (мг/куб. дм) | 65 | 15 | 22 | 42 | 53 |
| Св. 0,005 до 0,010 вкл. (мг/куб. дм) | 47 | 12 | 18 | 33 | 44 | ||
| Почва | От 0,010 до 0,05 вкл. | 80 | 16 | 24 | 44 | 59 | |
| Св. 0,05 до 0,10 вкл. | 70 | 11 | 18 | 31 | 45 | ||
| Зерно | От 0,010 до 0,05 вкл. | 73 | 15 | 22 | 42 | 53 | |
| Св. 0,05 до 0,10 вкл. | 55 | 10 | 16 | 28 | 40 | ||
| Солома | От 0,05 до 0,10 вкл. | 60 | 13 | 20 | 36 | 49 | |
| Св. 0,10 до 0,5 вкл. | 50 | 9 | 14 | 25 | 35 | ||
3. Метод измерений
Метод основан на экстракции E- и Z-изомеров флуоксастробина из воды гексаном, из почвы, зерна и соломы водным раствором ацетона, очистке экстрактов, содержащих флуоксастробин, от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с флоризилом, с последующим измерением содержания E- и Z-изомеров флуоксастробина в очищенных экстрактах на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектированием, обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки, расчетом содержания каждого из изомеров. За содержание флуоксастробина в образцах воды, почвы, зерна, соломы принимают сумму концентраций изомеров.
4. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
4.1. Средства измерений
Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны (фирма Knauer, Германия) (номер Госреестра 16848-03)
Весы аналитические Sartorius 6110 с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и пределом допустимой погрешности 0,0001 г ГОСТ 24104-2001
Весы лабораторные Metler P-160 с наибольшим пределом взвешивания 160 г и пределом допустимой погрешности 0,005 г ГОСТ 24104-2001
Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-1000-2 ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные 1-1-2-1; 1-1-2-2; 1-2-2-5; 1-2-2-10 ГОСТ 29227-91
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой П-2-5-0,1; П-2-10-0,2 ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные 1-25; 1-50; 1-100; 1-500; 1-1000 ГОСТ 1770-74
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 100 куб. мм, модель Microliter # 1710 («Hamilton», США)
4.2. Реактивы
E-изомер флуоксастробина (CAS 193740-76-0) с содержанием основного вещества не менее 99,5%, аналитический стандарт (Байер, Германия)
Z-изомер флуоксастробина (CAS 361377-29-9) с содержанием основного вещества не менее 99,8%, аналитический стандарт (Байер, Германия)
Ацетон квалификации чда ГОСТ 2603-79
Ацетонитрил для хроматографии квалификации хч ТУ 6-09-3534-87
Вода бидистиллированная или деионизированная ГОСТ 6709-72
н-Гексан квалификации хч ТУ 6-09-3375-78
Калий углекислый квалификации хч ГОСТ 4221-76
Калия перманганат квалификации хч ГОСТ 20490-75
Кальция хлорид квалификации хч ГОСТ 4161-77
Кислота серная квалификации хч ГОСТ 4204-77
Кислота уксусная ледяная квалификации чда ГОСТ 61-75
Натрия сульфат безводный квалификации хч ГОСТ 4166-76
Натрий углекислый квалификации хч ГОСТ 83-63
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) квалификации ч ГОСТ 22300-76
4.3. Вспомогательные устройства, материалы
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78
Ванна ультразвуковая, модель D-50, фирма Branson Instr. Co. (США)
Дистиллятор Cyclon III, модель 4 BD (Fistreem, Великобритания)
Установка Elgastat B 114 с патроном Elgacan B 114 для получения деионизированной воды (Elga, Великобритания)
Воронки делительные вместимостью 100 и 250 куб. см ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные стеклянные ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 25, 100 и 250 куб. см ГОСТ 9737-93
Колбы плоскодонные вместимостью 250 куб. см ГОСТ 9737-93
Колонка хроматографическая стеклянная длиной 25 см и внутренним диаметром 8 — 10 мм
Колонка хроматографическая стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4,6 мм, Kromasil 100-C18, зернение 5 мкм
Мельница лабораторная электрическая ТУ 46-22-236-84
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ротационный вакуумный испаритель B-169 фирмы «Buchi» (Швейцария) ТУ 25-11-917-76
Стаканы химические вместимостью 100 и 500 куб. см ГОСТ 25336-82
Установка для перегонки растворителей с дефлегматором ГОСТ 9737-93 (ИСО 641-75)
Фильтры бумажные «красная лента» обеззоленные ТУ 6-09-2678-77
Фильтры мембранные диаметром 47 мм с размером пор 0,45 мкм, фирма Pall Corp., (США)
Флоризил (60 — 100 меш.) для колоночной хроматографии (Acros organics, Германия)
Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками, аналогичными приведенным в разделе 4.
5. Требования безопасности
5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88.
5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91, и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90.
5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.
5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.51313-03 и 2.2.5.2308-07.
6. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.
7. Требования к условиям измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия.
7.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу
- Температура воздуха (20 +/- 5) °C;
- атмосферное давление (84 — 106) кПа;
- относительная влажность воздуха не более 80%.
7.2. Условия хроматографического анализа
Температура колонки: комнатная.
Подвижная фаза: ацетонитрил — вода — уксусная кислота (с объемным соотношением компонентов 58:42:0,01).
Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.
Чувствительность: 0,001 ед. абсорбции на шкалу.
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.
Время удерживания E-изомера флуоксастробина: (12,0 +/- 0,2) мин.
Время удерживания Z-изомера флуоксастробина: (16,4 +/- 0,2) мин.
Линейный диапазон детектирования: 1 — 10 нг.
8. Подготовка к выполнению измерений
Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей, приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ, подготовка колонки с флоризилом, кондиционирование хроматографической колонки, градуировка хроматографа.
8.1. Очистка органических растворителей
8.1.1 Очистка ацетона
Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 куб. дм ацетона 10 г KMnO и 2 г K CO ). Срок хранения - 1 неделя. 4 2 3
8.1.2 Очистка этилацетата
Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%
Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого в конической колбе растворяют в 40 — 60 куб. см деионизированной воды. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем раствора до метки деионизированной водой. Срок хранения — 1 неделя.
Этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5% насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют. Срок хранения — 1 неделя.
8.1.3 Очистка гексана
Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом. Срок хранения — 1 неделя.
8.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 580 куб. см ацетонитрила, 0,1 куб. см уксусной кислоты и доводят объем раствора до метки бидистиллированной водой. Раствор перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.
8.3. Кондиционирование хроматографической колонки
Промывают хроматографическую колонку Kromasil 100-5C18 подвижной фазой для ВЭЖХ, приготовленной по п. 8.2, при скорости подачи растворителя 0,5 куб. см/мин. не менее 2 ч до установления стабильной базовой линии (дрейф базовой линии в течение 1 ч не более 5%, а уровень шумов не более 2% диапазона выходного сигнала на шкале измерений).
8.4. Подготовка колонки с флоризилом для очистки экстракта
Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 — 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г флоризила в 20 куб. см этилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 30 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
8.5. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания флуоксастробина из колонки с флоризилом
При отработке методики или поступлении новой партии флоризила проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания флуоксастробина из колонки с флоризилом.
В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора E-изомера флуоксастробина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле (п. 8.6.2). Раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 8.4. Промывают колонку 40 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 40 куб. см смеси гексан — этилацетат (6:4, по объему), отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 2 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 8.2, перемешивают, а затем хроматографируют в соответствии с п. 7.2.
По результатам обнаружения флуоксастробина в каждой из фракций определяют объем смеси гексан — этилацетат (6:4, по объему), необходимый для полного вымывания фунгицида из колонки.
8.6. Приготовление градуировочных растворов
8.6.1 Исходные растворы E- и Z-изомеров флуоксастробина для градуировки с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г E- или Z-изомера флуоксастробина, растворяют в (40 — 50) куб. см ацетонитрила, доводят объем раствора ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.
Раствор хранят при температуре не выше минус 18 °C в течение месяца.
8.6.2. Градуировочные растворы E- и Z-изомеров флуоксастробина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (раствор № 1)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора E- или Z-изомера флуоксастробина с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 8.6.1), раствор разбавляют ацетонитрилом и доводят объем до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов № 2 — 5.
Градуировочный раствор № 1 хранят при температуре не выше минус 18 °C в течение месяца.
8.6.3. Градуировочные растворы E- и Z-изомеров флуоксастробина с массовой концентрацией 0,05 — 0,50 мкг/куб. см (растворы № 2 — 5)
В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора E- или Z-изомера флуоксастробина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 8.6.2), объем доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.2, каждый раствор тщательно перемешивают, получают растворы № 2 — 5 с массовой концентрацией E- и Z-изомеров флуоксастробина 0,05; 0,10; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.
Растворы готовят непосредственно перед использованием.
8.7. Градуировка хроматографа
Градуировочные характеристики, выражающие зависимости площадей пиков (мкВ х с) от массовой концентрации E- или Z-изомера флуоксастробина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам (п. 8.6.3).
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 8.6.3) и анализируют при условиях п. 7.2. Осуществляют не менее 3 параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r.
По полученным данным строят градуировочные характеристики.
8.8. Контроль стабильности градуировочных характеристик
Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.
Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.
Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца по каждому из компонентов выполняется условие (1):
|S - S |
изм гр
------------ х 100 <= К , (1)
S гр
гр
где:
S , S - значение площади пика E- или Z-изомера флуоксастробина в
изм гр
образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной
характеристике соответственно, усл. ед.; К — норматив контроля: гр
где +/- дельта — границы относительной погрешности, % (табл. 1).
Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.
Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.
9. Отбор, подготовка и хранение проб
Отбор проб производят в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79) и правилами, определенными ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб», 17.4.3.01-83 «Почвы. Общие требования к отбору проб», 28168-89 «Почвы. Отбор проб», 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб», Р 50436-92 «Зерновые. Отбор проб зерна», 27262-87 «Корма растительного происхождения. Методы отбора проб».
Пробы воды анализируют в день отбора или замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре минус 18 °C не более 2 недель.
Образцы почвы подсушивают при комнатной температуре в течение 24 ч на воздухе в темноте, помещают в герметичную полиэтиленовую тару и хранят в холодильнике при температуре (4 — 6) °C не более 4 недель. Для длительного хранения образцы почвы замораживают и хранят при температуре минус 18 °C.
Пробы зерна и соломы высушивают до стандартной влажности (в соответствии с ГОСТ 10852-86) и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Перед проведением анализов зерно и солому измельчают.
9.1. Экстракция флуоксастробина
9.1.1. Вода. 100 куб. см предварительно отфильтрованной воды помещают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, приливают 50 куб. см гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз верхний органический слой отделяют и фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 куб. см гексана. Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 8.2), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание флуоксастробина по п. 10.
9.1.2. Почва. Навеску (20 г) воздушно-сухой почвы помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 100 куб. см смеси ацетон — вода (3:1, по объему), перемешивают. Суспензию помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Почву повторно экстрагируют 50 куб. см смеси ацетон — вода (3:1, по объему) в течение 30 мин. при встряхивании и фильтруют. Измеряют объем объединенного экстракта и 1/4 его часть, эквивалентную 5 г образца, переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.
9.1.3. Зерно, солома. Образец размолотого зерна (10 г) или соломы (5 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 25 куб. см деионизированной воды и спустя 30 мин. 75 куб. см ацетона. Колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена. Растительные остатки переносят в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см смеси ацетон — вода (3:1, по объему), помещают на встряхиватель на 30 мин. и суспензию фильтруют. Измеряют объем объединенного экстракта, отбирают 1/2 часть экстракта зерна, эквивалентную 5 г образца, или 1/5 часть экстракта соломы, эквивалентную 1 г образца, и переносят его в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстрактов по п. 9.2.
9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Отобранные аликвоты экстрактов почвы, зерна и соломы, полученные по п. п. 9.1.2 и 9.1.3 и помещенные в круглодонные колбы, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (не менее 5 куб. см) при температуре не выше 40 °C. Водный остаток переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. Колбу ополаскивают 40 куб. см деионизированной воды, которую также переносят в делительную воронку. К водному раствору приливают 30 куб. см гексана и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз гексановый слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя 30 и 20 куб. см гексана. Объединенную органическую фракцию упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.3.
9.3. Очистка экстракта на колонке с флоризилом
Сухой остаток экстрактов почвы, зерна и соломы, полученный по п. 9.2, растворяют в 3 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с флоризилом, подготовленную по п. 8.4. Колбу обмывают 2 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Колонку промывают 30 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Флуоксастробин элюируют с колонки 35 куб. см смеси гексан — этилацетат (6:4, по объему), собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток экстрактов почвы, зерна и соломы растворяют в 1 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, подготовленной по п. 8.2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание флуоксастробина по п. 10.
Полнота извлечения изомеров флуоксастробина при проведении всех операций подготовки пробы не менее 83% для образцов почвы, зерна и соломы и не менее 89% для образцов воды.
10. Выполнение измерений
10.1. В инжектор хроматографа вводят 20 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (п. п. 9.1.1 - 9.1.3), анализируют при условиях п. 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.
10.2. Для каждого образца воды, почвы, зерна и соломы повторяют операции по п. п. 9.1 - 9.3, 10.1.
11. Обработка результатов измерений
11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации «МультиХром для Window», версия 1.5x.
Альтернативная обработка результатов.
По градуировочным характеристикам находят значение массовой концентрации каждого из изомеров флуоксастробина в экстрактах, C, мкг/куб. см.
Массовую концентрацию E- и Z-изомеров флуоксастробина X (мг/куб. дм) в образцах воды рассчитывают по формуле (2):
C х V
экстр
X = ------------. (2) 0,89 х V воды
Массовую долю E- и Z-изомеров флуоксастробина X (мг/кг) в образцах почвы, зерна и соломы рассчитывают по формуле (3):
C х V
экстр
где:
C - значение массовой концентрации E- и Z-изомеров флуоксастробина в
экстракте, мкг/куб. см; V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. экстр см;
m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с флоризилом и последующего
хроматографического определения, г; V — объем анализируемой части образца воды, взятой на экстракцию, воды куб. см; 0,83 и 0,89 — коэффициент извлечения E- и Z-изомеров флуоксастробина, учитывающий все процедуры подготовки пробы.
Общее содержание флуоксастробина в каждом образце определяют как сумму массовых долей (для воды — массовых концентраций) E- и Z-изомеров.
11.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (4):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= r, (4)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты параллельных определений массовой концентрации
1 2
(доли) E- и Z-изомеров флуоксастробина, мг/куб. дм (мг/кг); r — значение предела повторяемости, % (табл. 1).
Если условие (4) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.
11.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:
_ _
X +/- 0,01 х дельта х X, при P = 0,95,
где:
_
X - среднее арифметическое значение результатов n определений,
признанных приемлемыми по п. 11.2, мг/куб. дм (мг/кг); +/- дельта — границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).
В случае если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале:
«массовая концентрация флуоксастробина в воде менее 0,001 мг/куб. дм (более 0,01 мг/куб. дм)»;
«массовая доля флуоксастробина в почве и зерне менее 0,01 мг/кг (более 0,10 мг/кг)»;
«массовая доля флуоксастробина в соломе менее 0,05 мг/кг (более 0,50 мг/кг)».
Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал флуоксастробина, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют и анализируют в соответствии с данной методикой.
12. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости
12.1 Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:
а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;
б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).
12.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.
12.3. Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD по формуле (5):
0,95
2 х |C - C | х 100
ср1 ср2
----------------------- <= CD , (5)
(C + C ) 0,95
ср1 ср2
где:
C , C - средние значения массовой концентрации (доли), полученные
ср1 ср2
в первой и второй лабораториях, мг/куб. дм (мг/кг); CD — значение критической разности, % (таблица 1). 0,95
Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.3).
При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (5.3.4).
13. Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории
Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 («Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений»), используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.
Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.
Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.
При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.
14. Разработчики
Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.