МУК 4.1.2912-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Пироксулама в воде, почве, зерне и соломе зерновых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
Актуально на 01.11.2026.
Как цитировать: "МУК 4.1.2912-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Пироксулама в воде, почве, зерне и соломе зерновых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания". МУК 4.1.2912-11. https://bukva.ai/docs/muk-4-1-2912-11
(утв. Роспотребнадзором 12.07.2011)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 12 июля 2011 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
12 июля 2011 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПИРОКСУЛАМА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
с момента утверждения
1. Разработаны: Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева; Учебно-научным консультационным центром «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 июля 2011 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Свидетельство о метрологической аттестации от 08.12.2010 № 0067.03.12.10.
Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Пироксулама в воде в диапазоне 0,005 — 0,050 мг/куб. дм и в почве в диапазоне 0,05 — 0,50 мг/кг, а также уровня его остаточных количеств в зерне в диапазоне 0,01 — 0,10 мг/кг и соломе зерновых культур в диапазоне 0,05 — 0,50 мг/кг.
Название действующего вещества по ИЮПАК: N-(5,7-диметокси[1,2,4]триазоло[1,5-a]пиримидин-2-ил)-2-метокси-4-(трифлорметил)пиридин-3-сульфонамид.
Структурная формула (не приводится).
Эмпирическая формула: C H F № O S. 14 13 3 6 5
Агрегатное состояние: твердое вещество.
Цвет, запах: порошок беловатого до светло-желтого цвета с характерным специфическим запахом либо беловатого цвета без определенного запаха. -7
Давление паров при 20 °С: < 1 х 10 Pa (при 20 °С).
Коэффициент распределения n-октанол-вода (при 20 °С):
Log K 10 ow pH 4 1,08; pH 7 -1,01; pH 9 -1,60.
Температура плавления: 208,3 °С.
Температура кипения и замерзания: разлагается до наступления температуры кипения.
Температура воспламенения: не воспламеняется.
Температура самовозгорания: > 400 °С.
Растворимость в воде (при 20 °С):
нетитрованная вода 0,0626 г/л; при pH = 4 0,0164 г/л; при pH = 7 3,20 г/л; при pH = 9 13,7 г/л.
Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, при 20 °С): метанол — 1,01; ацетон — 2,79; ксилол — 0,0352; 1,2-дихлорэтан — 3,94; n-гептан — < 0,001; этилацетат — 2,17; n-октанол — 0,073.
Стабильность в водных растворах (pH 5, 7, 9) (при 20 °С):
Краткая токсикологическая характеристика. Пироксулам относится к веществам малоопасным по острой пероральной (ЛД для крыс 2000 мг/кг) и
50
дермальной токсичности (ЛД для крыс более 5000 мг/кг), но к опасным 50 веществам по ингаляционной токсичности (ЛК для крыс (4 ч) 1100 мг/куб. 50 м). Оказывает раздражающее действие на кожу и слабо раздражающее действие на слизистые оболочки глаз кроликов.
Область применения. Пироксулам — селективный системный послевсходовый гербицид для борьбы с широким спектром однолетних злаковых и двудольных сорняков. Пироксулам принадлежит к группе сульфоанилидов (или триазолопиримидинов).
В России предлагается в качестве гербицида в посевах озимой и яровой пшеницы с нормой расхода готового препарата 0,4 — 0,5 куб. дм/га.
В России установлены следующие гигиенические нормативы:
ДСД — 1,0 мг/кг массы человека; ОДК в воде водоема — 0,002 мг/куб. дм; ОДК в почве — 0,2 мг/кг; МДУ (мг/кг): в зерне и соломе зерновых культур — 0,1.
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ДЛЯ ПИРОКСУЛАМА
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Вода | 0,005 — 0,01 | 40 | 1,16 | 3,23 | 3,85 |
| 0,01 — 0,05 | 30 | 1,05 | 2,92 | 3,48 | |
| Почва | 0,05 — 0,1 вкл. | 50 | 1,08 | 3,00 | 3,57 |
| 0,1 — 0,5 вкл. | 25 | 0,99 | 2,75 | 3,28 | |
| Зерно пшеницы | 0,01 — 0,1 вкл. | 50 | 1,31 | 3,65 | 4,35 |
| Солома пшеницы | 0,05 — 0,1 вкл. | 50 | 0,95 | 2,64 | 3,15 |
| 0,1 — 0,5 вкл. | 25 | 0,80 | 2,22 | 2,65 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА ДЛЯ ПИРОКСУЛАМА
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Полнота извлечения вещества, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % | |
| Вода | 0,005 | 0,005 — 0,05 | 94,78 | 3,7 | +/- 1,04 |
| Почва | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 74,80 | 3,5 | +/- 0,96 |
| Зерно пшеницы | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 73,43 | 4,8 | +/- 1,18 |
| Солома пшеницы | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 72,73 | 3,7 | +/- 0,86 |
2. Метод измерений
Метод основан на определении Пироксулама с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистке перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, очистки экстракта на колонках с окисью алюминия и концентрирующих патронах Диапак С и Диапак С16.
Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1. Средства измерений
Весы аналитические «OHAUS», EP 114 с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г, класс точности по ГОСТ 24104-2001 — специальный (I)
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г, «ACCULAB» V600, соответствуют классу точности по ГОСТ 24104-2001 — средний (III)
Колбы мерные на 10, 25, 50, 100, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74
Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см ГОСТ 29227-91
pH-метр/милливольтметр pH-150 0...14 pH; +/- 1999 мВ; номер госрегистрации № 10663
Хроматограф жидкостный Agilent 1200 LCMS с диодно- матричным детектором G1315B, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С и стандартным автосамплером для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему (1200 Series Autosampler с дозирующим объемом от 0,1 до 100 куб. мм); номер госрегистрации 16193-06
Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 куб. см ГОСТ 1770-74
Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Пироксулам, CAS 422556-08-9, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 100,0%, фирма Dr. Ehreustorfer GmbH, аккредитованная по ИСО-9001-2000
Алюминий окись для хроматографии, ч ТУ 6-09-3916-75 Ацетон, осч ТУ 6-09-3513-86 Ацетонитрил, осч, УФ-200 нм ТУ 6-09-2167-84
Вода дистиллированная и (или) бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости) ГОСТ 6709-72
Гелий очищенный марки "А" ТУ 51-940-80 n-Гексан, хч ТУ 6-09-3818-89
Калий марганцово-кислый, чда ГОСТ 20490-75
Кальций хлористый, ч ТУ 6-09-4711-81
Кислота соляная, хч ГОСТ 857-95
Кислота муравьиная, чда ГОСТ 5848-73
Кислота уксусная ледяная, хч ГОСТ 61-75
Концентрирующие патроны Диапак С, Диапак С16 (0,6 г), фирма «БиоХимМак СТ» ТУ 4215-002-05451931-94
Натрий углекислый, кислый, хч ГОСТ 4201-79
Натрий серно-кислый безводный, хч ГОСТ 4166-76
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233-77
Этилацетат, чда ГОСТ 22300-76
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.3. Вспомогательные устройства и материалы
Алонж прямой с отводом для вакуума (АО-14/23) для работы с концентрирующими патронами Диапак С16 ГОСТ 25336-82
Аппарат для встряхивания проб «SKLO UNION TYP LT1»
Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. № 3120-0250, фирма «NALGENE»
Ванна ультразвуковая «UNITRA» UNIMA OLSZTYN UM-4
Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная ГОСТ 5556-81
Воронки делительные на 250 куб. см ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные стеклянные ГОСТ 25336-82
Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней
Колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1000 куб. см ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100, 250 и 4000 куб. см ТС ТУ 92-891.029-91
Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP18, зернение 5 мкм, фирма «Waters»
Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport
Предколонка хроматографическая стальная Zorbax Eclipse XDB-C8 длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, зернение 5 мкм, фирма «Agilent»
Сито лабораторное с полотном из латуни или ГОСТ 3826-82 и нержавеющей стали с размером ячеек 1 мм ГОСТ 6613-86
Стаканы стеклянные, термостойкие объемом 100 — 500 куб. см ГОСТ 25336-82
Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4000 куб. см и приемной конической колбой объемом 1000 куб. см
Фильтры бумажные «красная лента» ТУ 6-09-1678-86
Фильтры для очистки растворителей диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм, фирма «Waters»
Фильтр-патроны для шприцев Cromafil-PET 20/25 с размером пор 0,20 мкм
Центрифуга MPW-350e с числом оборотов 4000 об./мин. и с набором полипропиленовых банок емкостью 200 куб. см
Шприц инъекционный однократного применения объемом ГОСТ 24861-91 10 куб. см (ИСО 7886-84)
Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля точности анализа.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению определений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак С16 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на патронах, установление градуировочной характеристики.
7.1. Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.
7.1.2 Очистка ацетона
Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 г/куб. дм.
Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С, отбрасывают.
7.1.3 Приготовление бидистиллированной воды
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцово-кислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.
Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.
7.2. Приготовление растворов для проведения анализа
7.2.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил, очищенную воду и муравьиную кислоту.
В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 500 куб. см ацетонитрила, 500 куб. см очищенной воды и 1 куб. см муравьиной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.
7.2.2 Приготовление рабочих растворов
7.2.2.1 Приготовление 6 М раствора соляной кислоты.
Мерным цилиндром отбирают 246 куб. см концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 500 куб. см, куда предварительно наливают около 100 куб. см дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой). Готовый раствор хранят при комнатной температуре не более 30 суток.
7.2.3 Приготовление градуировочных растворов
7.2.3.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией Пироксулама 1,0 мг/куб. см.
Взвешивают 50 мг Пироксулама в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.
7.2.3.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией Пироксулама 10,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 2 используется для внесения в контрольные образцы и для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.
7.2.3.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией Пироксулама 1,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 3 хранится в холодильнике не более 30 суток и используется для установления градуировочной характеристики.
7.2.3.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией Пироксулама 0,5 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 4 хранится в холодильнике не более 30 суток и используется для установления градуировочной характеристики.
7.2.3.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией Пироксулама 0,2 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 5 хранится в холодильнике не более 30 суток и используется для установления градуировочной характеристики.
7.2.3.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией Пироксулама 0,1 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 6 хранится в холодильнике не более 30 суток и используется для установления градуировочной характеристики.
7.2.3.7. Стандартные растворы Пироксулама с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см для внесения в контрольные образцы.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 2,5; 1,0; 0,5; 0,4; 0,2 и 0,25 мкг/куб. см, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы. Стандартные растворы для внесения в контрольные образцы хранятся в холодильнике не более 30 суток.
7.3. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Пироксулама в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
7.4. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения Пироксулама на ней
7.4.1 Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 куб. см ацетонитрила.
7.4.2 Проверка хроматографического поведения Пироксулама на колонке с окисью алюминия
В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Пироксулама в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 куб. см и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.
Исходную колбу обмывают шестью порциями смеси ацетонитрила с ледяной уксусной кислотой в соотношении 99:1 объемом 10 куб. см каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы объемом по 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие Пироксулам, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.
Изучение поведения Пироксулама на колонке с окисью алюминия проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.
7.5. Подготовка концентрирующих патронов Диапак С для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения Пироксулама на них
7.5.1 Подготовка концентрирующих патронов Диапак С для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. (1 — 2 кап./с).
Патрон Диапак С устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1, затем 10 куб. см гексана. Элюаты отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
7.5.2 Проверка хроматографического поведения Пироксулама на концентрирующих патронах Диапак С
Из стандартного раствора Пироксулама в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см гексана, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.
Исходный концентратор обмывают последовательно 10 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1, затем 10 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:2, затем двумя порциями смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:2 объемом 5 куб. см каждая и последовательно вносят их на патрон.
Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие Пироксулам, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения Пироксулама на концентрирующих патронах Диапак С проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
7.6. Подготовка концентрирующих патронов Диапак С16 для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения Пироксулама на них
7.6.1 Подготовка концентрирующих патронов Диапак С16 для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. (1 — 2 кап./с).
Патрон Диапак С16 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси ацетонитрила с водой соотношении 1:1, затем 10 куб. см воды. Элюаты отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
7.6.2 Проверка хроматографического поведения Пироксулама на концентрирующих патронах Диапак С16
Из стандартного раствора Пироксулама в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см воды, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.
Исходный концентратор обмывают последовательно двумя порциями смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4 объемом 10 куб. см каждая и последовательно вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие Пироксулам, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения Пироксулама на концентрирующих патронах Диапак С16 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
7.7. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии
Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Zorbax Eclipse XDB-C8 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 0,5 куб. см/мин. 3 — 4 ч.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», № 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб», ГОСТ 17.4.3.01-83 «Почвы. Общие требования к отбору проб», ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб», ГОСТ 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна» и ГОСТ 27262-87 «Корма растительного происхождения. Методы отбора проб».
Пробы воды хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С; пробы почвы — в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °С.
Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.
9. Подготовка проб и выполнение измерений
9.1. Вода
9.1.1 Экстракция
Пробу воды объемом 100 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, прибавляют 5 г хлористого натрия и 1 куб. см 6 М соляной кислоты (до pH 3,5), перемешивают до полного растворения соли. Пироксулам экстрагируют тремя порциями эфира объемом по 30 куб. см, встряхивая каждый раз делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (диэтиловый эфир) объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, собирая его через слой безводного сульфата натрия. Экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 5 куб. см смеси ацетонитрила с водой и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.2. Почва
9.2.1 Экстракция
Пробу почвы весом 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 куб. см, прибавляют туда 5 куб. см воды и выдерживают 10 мин. при комнатной температуре. Пироксулам экстрагируют 50 куб. см ацетона, помещая на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин. на скорости 4000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 куб. см ацетона и помещая каждый раз на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Пробы центрифугируют, фильтруют, экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см и выпаривают до водного (~ 5 мл) остатка при температуре не выше 30 °С.
9.2.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
К водному остатку в концентраторе, полученному по п. 9.2.1, прибавляют 100 куб. см дистиллированной воды, 5 г хлорида натрия и 1 куб. см 6 М соляной кислоты (до pH 3,5), перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Пироксулам экстрагируют тремя порциями эфира объемом по 30 куб. см, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз верхний слой (эфир) собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.
9.2.3 Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С
Сухой остаток, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 2 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1, элюат также отбрасывают. Пироксулам элюируют 15 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:2. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток подвергают дальнейшей очистке на колонке с окисью алюминия.
9.2.4 Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия
Сухой остаток, полученный в п. 9.2.3, растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, наносят на подготовленную колонку, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99:1, элюат также отбрасывают. Пироксулам элюируют 40 куб. см смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99:1. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 5 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.3. Зерно пшеницы
9.3.1 Экстракция
Образец измельченного зерна пшеницы массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 куб. см, прибавляют туда 5 куб. см воды и выдерживают 10 мин. при комнатной температуре. Пироксулам экстрагируют 50 куб. см ацетона, помещая на 4 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин. на скорости 4000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 куб. см ацетона и помещая каждый раз на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Пробы центрифугируют, фильтруют, экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см и выпаривают до водного остатка при температуре не выше 30 °С.
9.3.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
К водному остатку в концентраторе, полученному по п. 9.3.1, прибавляют 100 куб. см дистиллированной воды, 5 г хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Полученную водную фракцию промывают двумя порциями гексана по 50 куб. см, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а водную фракцию переносят в чистую делительную воронку и доводят pH до значения 3,5 с помощью 6 М HCl.
Пироксулам экстрагируют тремя порциями эфира объемом по 30 куб. см, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз верхний слой (эфир) собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.
9.3.3 Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С
Сухой остаток, полученный по п. 9.3.2, растворяют в 2 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см гексана, перемешивают и очищают на патронах Диапак С, как указано в п. 9.2.3.
9.3.4 Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия
Сухой остаток, полученный по п. 9.3.3, растворяют в 10 куб. см ацетонитрила и очищают на колонке с окисью алюминия, как указано в п. 9.2.4.
После очистки элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С и подвергают дальнейшей очистке на концентрирующих патронах Диапак С16.
9.3.5 Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С16
Сухой остаток, полученный по п. 9.3.4, растворяют в 2 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см воды, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат собирают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, элюат также собирают в концентратор объемом 100 куб. см.
После очистки элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.4. Солома пшеницы
9.4.1 Экстракция
Образец измельченной ножницами соломы пшеницы массой 5 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, прибавляют 10 куб. см воды и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Пироксулам экстрагируют 50 куб. см ацетона, помещая на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 куб. см ацетона и помещая каждый раз на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракты фильтруют, объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см и выпаривают до водного остатка при температуре не выше 30 °С.
Далее проводят очистку экстракта по п. 9.3.2 «Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей», по п. 9.2.3 «Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С», по п. 9.2.4 «Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия» и по п. 9.3.5 «Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С16».
После очистки элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2,5 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.5. Условия хроматографирования
Хроматограф жидкостный Agilent 1200 LCMS с диодно-матричным детектором G1315B с изменяемой длиной волны, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С и стандартным автосамплером для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему (1200 Series Autosampler с дозирующим объемом от 0,1 до 100 куб. мм).
Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 х 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма «Waters».
Предколонка стальная Zorbax Eclipse XDB-C8, 12,5 х 2,1 мм, зернение 5 мкм, фирма «Agilent».
Подвижная фаза: ацетонитрил — вода — муравьиная кислота в соотношении 500:500:1.
Скорость потока подвижной фазы: 0,5 мл/мин.
Время удерживания Пироксулама: 10,378 мин. +/- 3%.
Чувствительность не менее 10 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.
10. Обработка результатов
Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Agilent Technologies ChemStation for LC 3D.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание Пироксулама рассчитывают по формуле:
S х А х V
пр
Х = ------------- х Р, 100 х S х m ст
где:
Х - содержание Пироксулама в пробе, мг/кг;
S - высота (площадь) пика стандарта, мм;
ст
S - высота (площадь) пика образца, мм;
пр
А - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m - масса анализируемого образца, г (куб. см);
Р - содержание Пироксулама в аналитическом стандарте, %.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 х сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(Х +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности P = 0,95,
где:
_
Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
дельта х Х
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,1 мг/кг» <*>.
<*> 0,1 мг/кг — предел обнаружения.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,Х л,Х' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,Х л,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
дельта х Х
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
_ _ К = Х' - Х - С , к д _ _ где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,Х' л,Х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций, табл. 1), %.
14. Разработчики
Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева.
Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов».