МУК 4.1.2909-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Тиенкарбазон-метила в воде, почве, зеленой массе, зерне и масле кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 12.07.2011)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 12 июля 2011 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
12 июля 2011 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТИЕНКАРБАЗОН-МЕТИЛА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ЗЕРНЕ И МАСЛЕ КУКУРУЗЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2909-11
1. Разработаны: Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева; Учебно-научным консультационным центром «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 июля 2011 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Свидетельство о метрологической аттестации № 0072.06.12.10 от 08.12.2010.
Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Тиенкарбазон-метила в воде в диапазоне 0,005 — 0,05 мг/куб. дм и в почве в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг, а также уровня его остаточных количеств в зеленой массе кукурузы в диапазоне 0,02 — 0,2 мг/кг, в зерне и масле кукурузы в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг.
Название действующего вещества по ИЮПАК: 3-тиофенкарбоновая кислота, 4-[[[(4,5-дигидро-3-метокси-4-метил-5-оксо-1H-1,2,4-триазол-1-ил)карбонил]амино]сульфонил]-5-метил, метиловый эфир.
Структурная формула (не приводится).
Эмпирическая формула: C H № O S . 12 14 4 7 2
Цвет, запах: химически чистый Тиенкарбазон-метил представляет собой белый порошок с легким характерным запахом.
Температура плавления: > 401 °С.
Температура кипения и замерзания: не определена, т.к. разрушается при 140 °С.
Температура вспышки и воспламенения: более 386 °С.
Плотность: 1,51 г/куб. см при 20 °С.
Давление паров в мм рт. ст. при Т 20 и 40 °С: -14
8,8 х 10 Па при 20 °С (экстраполированный); -13
3,7 х 10 Па при 25 °С (экстраполированный); -10
2,3 х 10 Па при 50 °С (экстраполированный).
Коэффициент распределения октанол-вода:
P Log P ow ow pH 4 0,738 -0,13 pH 7 0,010 -1,98 pH 9 0,0073 -2,14.
Растворимость в воде: 72 мг/л (при 20 °С, pH 3,9).
Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, при 20 °С): дихлорметан 100 - 120, ацетон - 9,54, этилацетат - 2,19, толуен - 0,91,
-3
этанол - 0,23, П-гексан - 0,15 х 10 . Краткая токсикологическая характеристика. Тиенкарбазон-метил относится к малоопасным по острой оральной (ЛД для крыс более 2000 мг/кг) и
50
дермальной токсичности (ЛД для крыс более 2000 мг/кг), но умеренно 50 опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК для крыс (4 ч) более 50 2018 мг/куб. м воздуха). Тиенкарбазон-метил нефро- и нейротоксичен.
В организме животных Тиенкарбазон-метил метаболизируется слабо, в растениях разлагается быстро и полностью. Главными метаболитами в растениях
являются BYH 18636-ММТ-глюкозид и BYH 18636-N-десметил. В полевых условиях ДТ Тиенкарбазон-метила составляет от 3 до 44,6 дня, ДТ от 9,9 до 148 50 90 дней. Тиенкарбазон-метил фотолитически стабилен. ДТ в воде составляет
50
от 130 до 148 дней.
Область применения препарата. Тиенкарбазон-метил — гербицид системного действия, быстро поглощается листьями и корневой системой сорняков, свободно перемещается по всему растению с нисходящими и восходящими токами питательных веществ. Благодаря системному действию препарат проникает во все части растения, включая «спящие» почки. На биохимическом уровне гербицид воздействует на фермент ацетолактатсинтазу (ALS), участвующий в цепи биосинтеза аминокислот, и нарушает процессы синтеза белков, что вызывает прекращение деления клеток в меристемных тканях сорных растений.
Рекомендуется как довсходовый и послевсходовый гербицид для контроля однолетних и многолетних злаковых и двудольных сорняков на посевах кукурузы. Рекомендуемая норма расхода препарата 0,4 — 0,5 л/га. Способ применения — наземное опрыскивание почвы до всходов культуры (без заделки) или в фазу 2 — 3 листьев культуры.
В России проходит регистрационные испытания в качестве гербицида для борьбы с однолетними и многолетними злаковыми и двудольными сорными растениями в посевах кукурузы с рекомендуемой нормой расхода по препарату 0,5 куб. м/га, при однократной обработке за сезон.
МДУ Тиенкарбазон-метила (в импортируемой продукции): зерно кукурузы — 0,01 мг/кг.
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Вода | 0,005 — 0,01 вкл. | 40 | 1,18 | 3,27 | 3,89 |
| 0,01 — 0,05 вкл. | 30 | 0,59 | 1,64 | 1,95 | |
| Почва | 0,01 — 0,1 вкл. | 50 | 1,16 | 3,22 | 3,84 |
| Зеленая масса | 0,02 — 0,1 вкл. | 50 | 1,12 | 3,11 | 3,71 |
| кукурузы | 0,1 — 0,2 вкл. | 25 | 0,79 | 2,18 | 2,60 |
| Зерно кукурузы | 0,01 — 0,1 вкл. | 50 | 0,81 | 2,25 | 2,67 |
| Масло кукурузы | 0,01 — 0,1 вкл. | 50 | 0,86 | 2,39 | 2,85 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТАНДАРТНОЕ ОТКЛОНЕНИЕ,
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА
ДЛЯ ТИЕНКАРБАЗОН-МЕТИЛА
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Полнота извлечения вещества, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % | |
| Вода | 0,005 | 0,005 — 0,05 | 93,03 | 1,10 | 0,48 |
| Почва | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 73,34 | 2,28 | 0,78 |
| Зеленая масса кукурузы | 0,02 | 0,02 — 0,2 | 72,03 | 2,34 | 0,79 |
| Зерно кукурузы | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 85,77 | 2,30 | 0,92 |
| Масло кукурузы | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 87,60 | 2,40 | 0,98 |
2. Метод измерений
Метод основан на определении Тиенкарбазон-метила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, на концентрирующих патронах Диапак Диол и на колонках с окисью алюминия.
Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1. Средства измерений
Весы аналитические «OHAUS», EP 114 с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г, класс точности по ГОСТ 24104-2001 — специальный (1)
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г
«ACCULAB» V600, соответствуют классу точности по ГОСТ 24104-2001 — средний (III)
Колбы мерные на 10, 25, 50, 100, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74
Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см ГОСТ 29227-91
pH-метр/милливольтметр pH-150 0...14 pH; +/- 1999 мВ, номер госрегистрации № 10663
Хроматограф жидкостный Agilent 1200 LCMS с диодно-матричным детектором G1315B, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С и стандартным автосамплером для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему (1200 Series Autosampler с дозирующим объемом от 0,1 до 100 куб. мм); номер госрегистрации 16193-06
Цилиндры мерные на 10, 25, 50 и 100 куб. см ГОСТ 1770-74
Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Тиенкарбазон-метил, CAS 317815-83-1, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 99,6%, фирма Dr. Ehreustorfer GmbH, аккредитованная по ИСО 9001-2000
Алюминий окись для хроматографии, ч ТУ 6-09-3916-75 Ацетон, осч ТУ 6-09-3513-86 Ацетонитрил, осч, УФ-200 нм ТУ 6-09-2167-84
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72 и (или) бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости)
Гелий, очищенный марки "А" ТУ 51-940-80 n-Гексан, хч ТУ 6-09-3818-89
Калий марганцово-кислый, чда ГОСТ 20490-75
Калий фосфорно-кислый двузамещенный, 3-х водный, чда ГОСТ 2493-75
Кальций хлористый, ч ТУ 6-09-4711-81
Кислота соляная, хч ГОСТ 3118-77
Кислота муравьиная, чда ГОСТ 5848-73
Кислота уксусная, ледяная, хч ГОСТ 61-75
Концентрирующие патроны Диапак Диол (0,6 г),
фирма "БиоХимМак СТ" ТУ 4215-002-05451931-94 Метилен хлористый, хч ТУ 6-09-2662-77
Натрий серно-кислый, безводный, хч ГОСТ 4166-76
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233-77
Натрий углекислый, кислый, хч ГОСТ 4201-79
Этилацетат, чда ГОСТ 22300-76
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.3. Вспомогательные устройства и материалы
Алонж прямой с отводом для вакуума (АО-14/23) для работы с концентрирующими патронами Диапак Диол ГОСТ 25336-82
Аппарат для встряхивания проб «SKLO UNION TYP LT1»
Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. № 3120-0250, фирма «NALGENE»
Ванна ультразвуковая «UNITRA» UNIMA OLSZTYN UM-4
Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная ГОСТ 5556-81
Воронки делительные на 250 куб. см ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные, стеклянные ГОСТ 25336-82
Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней B-480, фирма «Buchi»
Колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1000 куб. см ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100, 250 и 4000 куб. см ТС ТУ 92-891.029-91
Колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP18, зернение 5 мкм, фирма «Waters»
Насос диафрагменный FT.19, фирма «KNF Neu Laboport»
Предколонка хроматографическая стальная, Zorbax Eclipse XDB-C8, длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, зернение 5 мкм, фирма «Agilent»
Сито лабораторное с полотном из латуни или ГОСТ 3826-82 и нержавеющей стали с размером ячеек 1 мм ГОСТ 6613-86
Стаканы стеклянные, термостойкие объемом 100 — 500 куб. см ГОСТ 25336-82
Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4000 куб. см и приемной конической колбой объемом 1000 куб. см
Фильтры бумажные, «красная лента» ТУ-6-09-1678-86
Фильтры для очистки растворителей, диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм, фирма «Waters»
Центрифуга MPW-350e с числом оборотов 4000 об./мин. и с набором полипропиленовых банок емкостью 200 куб. см
Шприц инъекционный однократного применения объемом ГОСТ 24861-91 10 куб. см (ИСО 7886-84)
Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению определений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия, концентрирующих патронов Диапак Диол для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия и на концентрирующих патронах Диапак Диол, установление градуировочной характеристики.
7.1. Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. м аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.
7.1.2 Очистка ацетона
Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 г/куб. дм.
Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С, отбрасывают.
7.1.3 Приготовление бидистиллированной воды
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцово-кислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.
Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.
7.1.4 Очистка хлористого метилена
Хлористый метилен промывают равным объемом 5%-го раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 12 — 24 ч. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °С, отбрасывают.
7.1.5 Очистка этилацетата
Этилацетат промывают равным объемом 5%-го раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 12 — 24 ч. Затем этилацетат сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей. Этилацетат перегоняют при температуре 77,1 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 77,1 °С, отбрасывают.
7.2. Приготовление растворов для проведения анализа
7.2.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, очищенную воду и муравьиную кислоту.
В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 400 куб. см ацетонитрила, 550 куб. см очищенной воды и 1 куб. см муравьиной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.
7.2.2 Приготовление рабочих растворов
7.2.2.1 Приготовление 6 М раствора соляной кислоты.
Мерным цилиндром отбирают 246 куб. см концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 500 куб. см, куда предварительно наливают около 100 куб. см дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).
7.2.2.2 Приготовление 1 М раствора гидроокиси натрия.
Переносят в мерную колбу на 500 куб. см 20 г гидроокиси натрия, добавляют 200 — 300 куб. см дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).
7.2.2.3. Приготовление 0,05 М раствора двузамещенного фосфорно-кислого калия.
Переносят в мерную колбу на 500 куб. см 5,7 г K HPO х 3H O и 50 г 2 4 2 NaCl, добавляют 200 - 300 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения солей, проверяют pH полученного раствора. Если pH
раствора менее 9, доводят его до указанного значения с помощью 1 М раствора гидроокиси натрия, контролируя pH. После достижения нужного значения pH объем доводят водой до метки.
7.2.3 Приготовление градуированных растворов
7.2.3.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией Тиенкарбазон-метила 1,0 мг/куб. см.
Взвешивают 50 мг Тиенкарбазон-метила в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.
7.2.3.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией Тиенкарбазон-метила 10,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.
7.2.3.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией Тиенкарбазон-метила 1,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор № 3 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.
7.2.3.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией Тиенкарбазон-метила 0,5 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор № 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.
7.2.3.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией Тиенкарбазон-метила 0,2 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор № 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.
7.2.3.6. Стандартный раствор с концентрацией Тиенкарбазон-метила 0,1 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор № 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.
7.2.3.7. Стандартные растворы Тиенкарбазон-метила с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0; 0,4; и 0,2 мкг/куб. см для внесения в образцы.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; 0,4; и 0,2 мкг/куб. см и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.
Методом последовательного разведения ацетоном стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,4 и 0,2 мкг/куб. см и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы зерна и масла.
7.3. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Тиенкарбазон-метила в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.6. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
7.4. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения Тиенкарбазон-метила на ней
7.4.1 Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 куб. см ацетонитрила.
7.4.2 Проверка хроматографического поведения Тиенкарбазон-метила на колонке с окисью алюминия
В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Тиенкарбазон-метила в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Исходную колбу обмывают пятью порциями смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99:1 объемом 10 куб. см каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие Тиенкарбазон-метил, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.
Изучение поведения Тиенкарбазон-метила на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.
7.5. Подготовка концентрирующих патронов Диапак Диол для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения Тиенкарбазон-метила на них
7.5.1 Подготовка концентрирующих патронов Диапак Диол для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. (1 — 2 кап./с).
Патрон Диапак Диол устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1, затем 10 куб. см гексана. Элюаты отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
7.5.2 Проверка хроматографического поведения Тиенкарбазон-метила на концентрирующих патронах Диапак Диол
Из стандартного раствора Тиенкарбазон-метила в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см гексана, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм хроматографируют. Исходный концентратор обмывают последовательно 10 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1, затем 10 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:2, затем тремя порциями 1%-й уксусной кислоты в этилацетате объемом 10 куб. см каждая и последовательно вносят их на патрон.
Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие Тиенкарбазон-метил, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения Тиенкарбазон-метила на концентрирующих патронах Диапак Диол проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.
7.6. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии
Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Zorbax Eclipse XDB-C8 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 — 4 ч.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» № 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб», ГОСТ 17.4.3.01-83 «Почвы. Общие требования к отбору проб», ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб», ГОСТ 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ 8808-2000 «Масло кукурузы, ТУ» и ГОСТ 5471-83 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб».
Пробы воды хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С; пробы почвы — в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °С.
Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.
Зеленую массу кукурузы хранят в морозильной камере при температуре -18 °С.
Отобранные пробы зерна кукурузы подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов. Перед анализом пробы зерна кукурузы измельчают на лабораторной мельнице.
Пробы кукурузного масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 — 4 °С.
9. Подготовка проб и выполнение измерений
Анализ образцов должен быть выполнен в течение одного дня.
9.1. Вода
9.1.1 Экстракция
Пробу воды объемом 100 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, прибавляют туда 5 г хлористого натрия и 1 куб. см 6 М раствора соляной кислоты (до pH 6), перемешивают до полного растворения соли. Тиенкарбазон-метил экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см, встряхивая каждый раз делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, собирая его через слой безводного сульфата натрия. Хлористый метилен выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 5 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.2. Почва
9.2.1 Экстракция и очистка полученного экстракта
Пробу почвы весом 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 куб. см, прибавляют туда 10 куб. см воды и выдерживают 10 мин. при комнатной температуре. Тиенкарбазон-метил экстрагируют 50 куб. см ацетонитрила в течение 5 мин. в ультразвуковой ванне. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин. на скорости 4000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют в делительную воронку объемом 250 куб. см через фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 куб. см ацетонитрила и помещая каждый раз на 5 мин. в ультразвуковую ванну. Пробы центрифугируют, экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке объемом 250 куб. см.
К ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 куб. см гексана и встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний слой (ацетонитрил) возвращают в делительную воронку и повторяют процедуру еще раз, используя 50 куб. см гексана. Нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.
9.2.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.2.1, прибавляют 5 куб. см ацетона, обмывая стенки колбы, затем прибавляют 50 куб. см щелочного буфера pH 9, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Полученную водную фракцию промывают двумя порциями хлористого метилена по 30 куб. см, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) отбрасывают, а водную фракцию переносят в чистую делительную воронку и доводят pH раствора до значения 3,5 с помощью 6 М HCl.
Тиенкарбазон-метил экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 20 куб. см, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор объемом 250 куб. см, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.
9.2.3 Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак Диол
Сухой остаток, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 2 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают последовательно 10 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1, затем 10 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:2, элюаты также отбрасывают. Тиенкарбазон-метил элюируют 20 куб. см 1% уксусной кислоты в этилацетате. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.3. Зеленая масса кукурузы
9.3.1 Экстракция
Образец измельченной зеленой массы кукурузы массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, прибавляют 75 куб. см ацетонитрила и помещают на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 куб. см ацетонитрила и помещая на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
9.3.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Сухой остаток, полученный по п. 9.3.1, растворяют в 5 куб. см ацетона и проводят очистку экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, как указано в п. 9.2.2.
9.3.3 Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак Диол
Сухой остаток, полученный по п. 9.3.2, растворяют в 2 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см гексана, перемешивают и проводят очистку экстракта на концентрирующих патронах Диапак Диол, как указано в п. 9.2.3.
9.3.4 Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия
Сухой остаток, полученный в п. 9.3.3, растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, наносят на подготовленную колонку, элюат отбрасывают. Тиенкарбазон-метил элюируют 40 куб. см смеси ацетонитрила с уксусной кислотой в соотношении 99:1. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.4. Зерно кукурузы
9.4.1 Экстракция
Образец измельченного зерна кукурузы массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 куб. см, прибавляют 50 куб. см ацетонитрила и помещают на 5 мин. в ультразвуковую ванну. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин. на скорости 4000 оборотов в минуту. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 куб. см ацетонитрила и помещая на 5 мин. в ультразвуковую ванну. Пробы центрифугируют, экстракты фильтруют и объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.2 «Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей», по п. 9.2.3 «Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак Диол» и по п. 9.3.4 «Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия».
После очистки элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.5. Масло кукурузы
9.5.1 Экстракция и очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Из пробы кукурузного масла отбирают в стакан навеску массой 20 г и переносят ее в делительную воронку объемом 250 куб. см тремя порциями гексана объемом по 30 куб. см. Тиенкарбазон-метил экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 куб. см, встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой сливают в коническую колбу объемом 100 куб. см. Верхний слой (гексан) отбрасывают.
Ацетонитрильный экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см и промывают одной порцией гексана объемом 100 куб. см, встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Далее проводят очистку экстракта на концентрирующих патронах Диапак Диол, как указано в п. 9.2.3 «Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак Диол».
После очистки элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
9.6. Условия хроматографирования
Хроматограф жидкостной Agilent 1200 LCMS с диодно-матричным детектором G1315B с изменяемой длиной волны, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С и стандартным автосамплером для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему (1200 Series Autosampler с дозирующим объемом от 0,1 до 100 куб. мм).
Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 мм х 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма «Waters».
Предколонка стальная Zorbax Eclipse XDB-C8, 12,5 мм х 2,1 мм, зернение 5 мкм, фирма «Agilent».
Подвижная фаза: ацетонитрил — вода — муравьиная кислота в соотношении 400:550:1.
Время удерживания Тиенкарбазон-метила: 7,974 мин. +/- 3%.
Чувствительность не менее 10 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.
10. Обработка результатов
Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Agilent Technologies ChemStation for LC 3D.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание Тиенкарбазон-метила рассчитывают по формуле:
S х A х V
пр
X = ------------- х P, 100 х S х m ст
где:
X - содержание Тиенкарбазон-метила в пробе, мг/кг или мг/куб. дм;
S - высота (площадь) пика стандарта, мм;
ст
S - высота (площадь) пика образца, мм;
пр
A - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m - масса анализируемого образца, г (куб. см);
P - содержание Тиенкарбазон-метила в аналитическом стандарте, %.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 х сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности P = 0,95,
где:
_
X - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
дельта х X
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг» <*>
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию: д
C = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,X л,X' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,X л,X' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
дельта х X
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры K рассчитывают по формуле: к
_ _ K = X' - X - C , к д _ _ где X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 K = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K ) с нормативом
к
контроля (K).
Если результат, контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций, табл. 1), %.
14. Разработчики
Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева.
Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов».