МУК 4.1.2903-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Биксафена в воде, почве, зерне и соломе зерновых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 12.07.2011)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 12 июля 2011 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
12 июля 2011 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ БИКСАФЕНА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
с момента утверждения
1. Разработаны: Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева; Учебно-научным консультационным центром «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 июля 2011 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Свидетельство о метрологической аттестации от 08.12.2010 № 0066.03.12.10.
Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Биксафена в воде в диапазоне 0,005 — 0,050 мг/куб. дм и в почве в диапазоне 0,01 — 0,10 мг/кг, а также уровня остаточных количеств в зерне зерновых культур в диапазоне 0,01 — 0,10 мг/кг и в соломе зерновых культур в диапазоне 0,02 — 0,20 мг/кг.
Название действующего вещества по ИЮПАК: N-(3',4'-дихлоро-5-флуробифенил-2-ил)-3-(дифлурометил)-1-метил-1Н-пиразол-4-карбоксоамид.
Структурная формула: (не приводится).
Эмпирическая формула: C H Cl F N O. 18 12 2 3 3
Агрегатное состояние: порошок.
Цвет, запах: белый, без запаха. -9
Давление паров: 4,6 х 10 Па (при 20 и при 40 °C).
Температура плавления: 146,6 °C.
Температура кипения: разлагается при 250 °C.
Коэффициент распределения октанол-вода (при 40 °C): K log P = 3,3. ow
Растворимость в воде, мг/куб. дм (20 °C): 0,49.
Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °C): этилацетат — 82; ацетон — более 250; дихлорметан — 102; метанол — 32; n-гептан — 0,056; диметилсульфоксид — более 250.
Биксафен не подвергается гидролизу при pH 4, 7, 9 в течение 5 дней при температуре 50 °C.
Краткая токсикологическая характеристика. Биксафен относится к веществам малоопасным по острой пероральной (ЛД для крыс более 5000
50
мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД для крыс более 2000 мг/кг). 50 Раздражает кожу кролика с полным восстановлением через 7 дней и слизистую оболочку глаз кролика с полным восстановлением через 14 дней.
Область применения. Биксафен — специфичный фунгицид против септориоза и ржавчины с длительным защитным действием. Относится к классу карбоксамидов и обладает локо-системным действием, подавляет прорастание спор и развитие мицелия. На биохимическом уровне ингибирует энзим сукцинат дегидрогеназу митохондриального респираторного канала.
Проходит регистрационные испытания в качестве фунгицида против большинства болезней, вызываемых грибами классов Аскомицеты, Базидиомицеты и Дейтеромицеты, на яровых и озимых зерновых с нормой расхода 0,8 — 1,0 л/га.
МДУ Биксафена (в импортируемой продукции): зерно пшеницы и ржи — 0,05 мг/кг, зерно ячменя и овса — 0,50 мг/кг.
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ДЛЯ БИКСАФЕНА
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Вода | 0,005 — 0,01 вкл. | 40 | 1,15 | 3,20 | 3,81 |
| 0,01 — 0,05 вкл. | 30 | 0,81 | 2,25 | 2,68 | |
| Почва | 0,01 — 0,1 вкл. | 50 | 1,22 | 3,39 | 4,03 |
| Зерно пшеницы | 0,01 — 0,1 вкл. | 50 | 2,03 | 5,64 | 6,72 |
| Солома пшеницы | 0,02 — 0,1 вкл. | 50 | 0,88 | 2,45 | 2,91 |
| 0,1 — 0,2 вкл. | 25 | 1,17 | 3,25 | 3,87 |
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА ДЛЯ БИКСАФЕНА
| Анализируемый | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| объект | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Полнота извлечения вещества, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
| Вода | 0,005 | 0,005 — 0,05 | 94,45 | 1,76 | 0,78 |
| Почва | 0,01 | 0,01 — 0,10 | 83,46 | 2,18 | 0,85 |
| Зерно пшеницы | 0,01 | 0,01 — 0,10 | 82,35 | 2,34 | 0,90 |
| Солома пшеницы | 0,02 | 0,02 — 0,2 | 75,96 | 2,36 | 0,84 |
2. Метод измерений
Метод основан на определении Биксафена с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, на колонках с окисью алюминия и на концентрирующих патронах Диапак С.
Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1. Средства измерений
Весы аналитические «OHAUS», ЕР 114 с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г, класс точности по ГОСТ 24104-2001 — специальный (I)
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г «ACCULAB» V600, соответствуют классу точности по ГОСТ 24104-2001 — средний (III)
Колбы мерные на 10, 25, 50, 100, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74
Микрошприц для жидкостной хроматографии, объем 100 куб. мм, фирма «Hamilton», кат. № 80665
Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см ГОСТ 29227-91 pH-метр/милливольтметр pH-150 0 ... 14 pH; +/- 1999 мВ, номер госрегистрации № 10663
Хроматограф жидкостный Agilent 1200 LCMS с диодно-матричным детектором G1315B, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °C и стандартным автосамплером для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему (1200 Series Autosampler с дозирующим объемом от 0,1 до 100 куб. мм); номер госрегистрации 16193-06
Хроматограф жидкостный Waters 515 c ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу, номер госрегистрации № 15311-02
Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 куб. см ГОСТ 1770-74
Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Биксафен, CAS 581809-46-3, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 98,9%, Фирма Dr. Ehreustorfer GmbH, аккредитованная по ИСО 9001-2000
Алюминий окись для хроматографии, ч ТУ 6-09-3916-75 Ацетон, осч ТУ 6-09-3513-86 Ацетонитрил, осч, УФ-200 нм ТУ 6-09-2167-84
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72 и (или) бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости)
Гелий, очищенный марки "А" ТУ 51-940-80 n-Гексан, хч ТУ 6-09-3818-89
Калий марганцово-кислый, чда ГОСТ 20490-75
Кальций хлористый, ч ТУ 6-09-4711-81
Концентрирующие патроны Диапак С (0,6 г), фирма «БиоХимМак СТ» ТУ 4215-002-05451931-94
Кислота соляная, хч, ГОСТ 857-95
Кислота муравьиная, чда ГОСТ 5848-73
Метилен хлористый, хч ТУ 6-09-2662-77
Натрий серно-кислый, безводный, хч ГОСТ 4166-76
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233-77
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.3. Вспомогательные устройства и материалы
Алонж прямой с отводом для вакуума (АО-14/23) для работы с концентрирующими патронами
Диапак Амин и Диапак С 16 ГОСТ 25336-82
Аппарат для встряхивания проб «SKLO UNION TYP LT1»
Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. № 3120-0250, фирма «NALGENE»
Ванна ультразвуковая «UNITRA» UNIMA OLSZTYN UM-4
Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная ГОСТ 5556-81
Воронки делительные на 250 куб. см ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные, стеклянные ГОСТ 25336-82
Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней В-480, фирма «Buchi»
Колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1000 куб. см ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100, 250 куб. см и 4000 куб. см ТС ТУ 92-891.029-91
Колонка хроматографическая стальная Zorbax Eclipce XDB-C18, длиной 150 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма «Agilent»
Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport
Предколонка хроматографическая стальная, Zorbax Eclipce XDB-C8, длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, зернение 5 мкм, фирма «Agilent»
Сито лабораторное с полотном из латуни или ГОСТ 3826-82 и нержавеющей стали с размером ячеек 1 мм ГОСТ 6613-86
Стаканы стеклянные, термостойкие объемом 100 — 500 куб. см ГОСТ 25336-82
Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4000 куб. см и приемной конической колбой объемом 1000 куб. см
Фильтры бумажные, «красная лента» ТУ-6-09-1678-86
Фильтры для очистки растворителей, диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм, фирма «Waters»
Центрифуга MPW-350e с числом оборотов 4000 об./мин. и с набором полипропиленовых банок емкостью 200 куб. см
Шприц инъекционный однократного ГОСТ 24861-91 применения объемом 10 куб. см (ИСО 7886-84)
Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению определений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия, концентрирующих патронов Диапак С для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия и на концентрирующих патронах Диапак С, установление градуировочной характеристики.
7.1. Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетона
Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 г/куб. дм.
Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.
7.1.2 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.
7.1.3 Приготовление бидистиллированной воды
Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.
Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.
7.2. Приготовление растворов для проведения анализа
7.2.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, очищенную воду и муравьиную кислоту.
В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 550 куб. см ацетонитрила, 450 куб. см очищенной воды и 1 куб. см муравьиной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.
7.2.2 Приготовление градуировочных растворов
7.2.2.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией Биксафена 1,0 мг/куб. см.
Взвешивают 50 мг Биксафена в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики.
7.2.2.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией Биксафена 10,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики.
7.2.2.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией Биксафена 1,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 3 используется для установления градуировочной характеристики.
7.2.2.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией Биксафена 0,5 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 4 используется для установления градуировочной характеристики.
7.2.2.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией Биксафена 0,2 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 5 используется для установления градуировочной характеристики.
7.2.2.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией Биксафена 0,1 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор № 6 используется для установления градуировочной характеристики.
7.2.2.7. Стандартные растворы Биксафена с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см для внесения в образцы.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.
7.2.3 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, очищенную воду и муравьиную кислоту.
В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 550 куб. см ацетонитрила, 450 куб. см очищенной воды и 1 куб. см муравьиной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.
7.3. Построение калибровочной кривой
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Биксафена в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
7.4. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения Биксафена на ней
7.4.1 Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 куб. см ацетонитрила.
7.4.2 Проверка хроматографического поведения Биксафена на колонке с окисью алюминия
В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Биксафена в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C. Исходную колбу обмывают еще двумя порциями ацетонитрила объемом по 10 куб. см каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие Биксафен, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.
Изучение поведения Биксафена на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.
7.5. Подготовка концентрирующих патронов Диапак С для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения Биксафена на них
7.5.1 Подготовка концентрирующих патронов Диапак С для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.
Патрон Диапак С устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, затем 10 куб. см гексана. Элюаты отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
7.5.2 Проварка хроматографического поведения Биксафена на концентрирующих патронах Диапак С
Из стандартного раствора Биксафена в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 куб. см, выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
Исходный концентратор обмывают сначала 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, затем двумя порциями по 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и вносят полученные растворы последовательно на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие Биксафен, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения Биксафен на концентрирующих патронах Диапак С проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.
7.6. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии
Хроматографическую колонку Zorbax Eclipce XDB-C18 с предколонкой Zorbax Eclipce XDB-C8 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 — 4 ч.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» № 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб», ГОСТ 17.4.3.01-83 «Почвы. Общие требования к отбору проб», ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб», ГОСТ 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна», ГОСТ 27262-87 «Корма растительного происхождения. Методы отбора проб».
Пробы воды хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °C; пробы почвы — в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °C.
Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.
9. Подготовка проб и выполнение измерений
9.1. Вода
9.1.1 Экстракция
Пробу воды объемом 100 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, прибавляют туда 10 г хлористого натрия, 1 куб. см 6 М соляной кислоты (до pH 1) и перемешивают до полного растворения соли. Биксафен экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см, встряхивая каждый раз делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, собирая его через слой безводного сульфата натрия. Экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Сухой остаток растворяют в 5 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм раствора вводят в хроматограф.
9.2. Почва, зерно и солома зерновых
9.2.1 Экстракция и очистка полученного экстракта
Пробу почвы (или измельченного зерна) весом 20 г (5 г для соломы) помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 куб. см, прибавляют туда 10 куб. см дистиллированной воды и выдерживают 5 мин. при комнатной температуре. Биксафен экстрагируют 50 куб. см ацетонитрила в течение 5 мин. в ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 4000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют через фильтр «красная лента» в делительную воронку объемом 250 куб. см. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 куб. см ацетонитрила и помещая каждый раз на 5 мин. в ультразвуковую ванну и дополнительно на 5 мин. на аппарате для встряхивания проб. Пробы центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 4000 оборотов в минуту, супернатант фильтруют. Экстракты объединяют в делительной воронке объемом 250 куб. см.
К полученному экстракту добавляют 50 куб. см гексана и интенсивно встряхивают воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще одной порцией гексана объемом по 50 куб. см. Гексан отбрасывают, а ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
9.2.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
К сухому остатку в концентраторе, полученному в п. 9.2.1, прибавляют 5 куб. см ацетонитрила, обмывают стенки концентратора, добавляют 100 куб. см дистиллированной воды, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Туда же прибавляют 10 г сухого хлорида натрия и интенсивно перемешивают до полного растворения соли. Биксафен экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см, каждый раз интенсивно встряхивая воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой хлористого метилена объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, собирая его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
9.2.3 Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия
Сухой остаток, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, наносят на заранее подготовленную колонку, элюат собирают в концентратор. Исходную колбу обмывают 10 куб. см ацетонитрила и вносят на колонку. Элюаты объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
9.2.4 Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С
Сухой остаток, полученный в п. 9.2.4, растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана, перемешивают и вносят на заранее подготовленный концентрирующий патрон Диапак С, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:9, элюат отбрасывают. Биксафен элюируют 10 куб. см смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:4, элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.
Сухой остаток растворяют в 2 куб. см (почва, зерно) и в 1 куб. см (солома) смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм раствора вводят в хроматограф.
9.3. Условия хроматографирования
Хроматограф жидкостный Agilent 1200 LCMS с диодно-матричным детектором G1315B с изменяемой длиной волны, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °C и стандартным автосамплером для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему (1200 Series Autosampler с дозирующим объемом от 0,1 до 100 куб. мм).
Колонка стальная Zorbax Eclipce XDB-C18, 150 мм х 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма «Agilent».
Предколонка стальная Zorbax Eclipce XDB-C8, 12,5 мм х 2,1 мм, зернение 5 мкм, фирма «Agilent».
Подвижная фаза: ацетонитрил — вода — муравьиная кислота в соотношении 550:450:1.
Время удерживания Биксафена: 8,405 +/- 3% мин.
Чувствительность не менее 10 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.
10. Обработка результатов
Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Agilent Technologies ChemStation for LC 3D.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание Биксафена рассчитывают по формуле:
S х A х V
пр
X = ------------- х P, 100 х S х m ст
где:
X - содержание Биксафена в пробе, мг/кг;
S - высота (площадь) пика стандарта, мм;
ст
S - высота (площадь) пика образца, мм;
пр
A - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m - масса анализируемого образца, г (куб. см);
P - содержание Биксафена в аналитическом стандарте, %.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 3
R — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 х сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности P = 0,95,
где:
_
X - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
дельта х X
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг» <*>.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию: д
C = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,X л,X' где +/- ДЕЛЬТА _ (ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности (абсолютная л,X л,X' погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с
добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
дельта х X
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры K рассчитывают по формуле: к
_ _ K = X' - X - C , к д _ _ где X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 K = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K ) с нормативом
к
контроля (K).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,
таблица 1), %.
14. Разработчики
Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева.
Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов».