МУК 4.1.2865-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Фенпропидина в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(утв. Роспотребнадзором 31.03.2011)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 31 марта 2011 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
31 марта 2011 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЕНПРОПИДИНА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
с момента утверждения
1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28.12.2010 № 3).
3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 марта 2011 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Общие положения и область применения
Свидетельство об аттестации методики от 25.06.2010 № 01.5.04.686.
Настоящий документ устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Фенпропидина в зеленой массе и зерне зерновых культур в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг и в соломе в диапазоне 0,04 — 0,4 мг/кг.
Действующее вещество: Фенпропидин.
Структурная формула (не приводится).
Название действующего вещества по ИЮПАК: (RS)-1-[3-(4-трет-бутилфенил)-2-метилпропил]пиперидин.
Эмпирическая формула: C H N. 19 31
Химически чистое вещество представляет собой бледно-желтую слегка вязкую жидкость без запаха.
Температура кипения > 250 °С, 70,2 °С/1,1 Ра.
Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода: K lg P = 2,9 ow (рН 7,25 °С).
Растворимость в воде (мг/куб. дм, 25 °С): 530 (рН 7); 6,2 (рН 9).
Легко смешивается с ацетоном, этанолом, толуолом, н-октанолом и гексаном (25 °С). Стабилен при хранении в закрытом контейнере при комнатной
температуре, по крайней мере, в течение 3 месяцев. Водные растворы устойчивы к воздействию УФ-света и гидролизу при 80 °С (рН 4, 7 и 10). рК 10,1 (сильное основание).
а
Краткая токсикологическая характеристика: у крыс острая оральная токсичность LD > 1447 мг/кг; при подкожном введении LD > 4000 мг/кг. 50 50 Ингаляционная токсичность LD 1220 мг в 1 куб. м воздуха (время
50
экспозиции 4 ч). У кроликов вызывает раздражение кожи и глаз.
Не обладает мутагенным, канцерогенным и тератогенным действием.
Область применения: Фенпропидин — лиственный фунгицид системного действия с целебным защитным и искореняющим эффектом. Подавляет развитие таких заболеваний зерновых культур, как ложномучнистая роса, ржавчина и пятна на листьях, вызываемые, соответственно, грибами из родов Erysiphe graminis, Puccinia SPP и Rhynchosporium secalis.
Гигиенические нормативы в России для фенпропидина: МДУ в зерне хлебных злаков 0,25 мг/кг.
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Объект анализа | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), сигма , % r | Показатель внутрилабораторной прецизионности, сигма , % Rл | Показатель воспроизводимости, сигма , % R | Показатель точности <*> (границы относительной погрешности), +/- сигма, % |
| Зеленая масса | 0,01 — 0,10 | 6 | 7 | 8 | 16 |
| Зерно | 0,01 — 0,10 | 6 | 7 | 8 | 16 |
| Солома | 0,04 — 0,10 0,10 — 0,40 | 5 3 | 6 4 | 8 5 | 16 10 |
| <*> Соответствует расширенной неопределенности U (в относительных отн. единицах) при коэффициенте охвата k = 2. | |||||
ДЛЯ n = 20, Р = 0,95
| Анализируемый объект | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S | Доверительный интервал среднего результата, +/- % |
|---|---|---|---|---|---|
| Зеленая масса | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 87,3 | 5,15 | 2,4 |
| Зерно | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 90,4 | 5,8 | 2,7 |
| Солома | 0,04 | 0,04 — 0,4 | 88,15 | 8,3 | 3,9 |
Методика основана на определении Фенпропидина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов смесью органического растворителя с водой и очистки экстракта путем перераспределения кислотно-основных форм Фенпропидина между двумя несмешивающимися фазами и методом твердофазной экстракции.
Идентификация Фенпропидина проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1 Средства измерений
Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ-детектором, снабженным дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-2001
Весы технические ВЛКТ-500 ГОСТ 24104-2001 рН-метр фирмы «Hanna Instrument», мод. Р212
Колбы мерные на 10, 50, 100, 1000 куб. см ГОСТ 23932-90
Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см
Пипетки градуированные ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные на 50 и 100 куб. см ГОСТ 23932-90
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или хч ТУ 6-09-3534-87 Гексан, хч ТУ 2631-003-05807999-98
Вода бидистиллированная, деионизированная ГОСТ 6709-79
Фенпропидин с содержанием основного вещества 97,7%, Мактешим Аган
Натрий сернокислый, безводный, хч ГОСТ 4166-76
Соляная кислота, 0,1М водный раствор
Гидроксид натрия, 1М водный раствор
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60
Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters)
Воронки лабораторные В-75-110 ГОСТ 25336-82
Ротационный вакуумный испаритель фирмы BUCHI, мод. R 205
Фильтры бумажные «красная лента» ТУ 6.091678-86
Патроны, заполненные силикагелем 60 (Merck), 0,5 г
Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.
4.1. При работе необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда — ГОСТ 12.0.004.
При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны».
5. Требования к квалификации операторов
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха 20 +/- 5 °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7.1 Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку (Acquity ВЕН С18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.
7.2 Приготовление растворов
7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: 0,5 +/- 0,01 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.
7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60 по объему, используя мерные цилиндры.
7.2.3. Приготовление элюента для твердофазной экстракции. В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 20 куб. см ацетона и доводят объем до метки гексаном. Перемешивают. Элюент хранят в вытяжном шкафу и используют свежеприготовленным.
7.3 Приготовление основного и градуировочных растворов
7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см: точную навеску Фенпропидина (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.
Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 0,75 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя подвижную фазу.
7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,2 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией 0,75 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят 7,5 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,5 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 5 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2,0 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.
При изучении полноты определения Фенпропидина в зеленой массе, зерне и соломе пшеницы используют ацетонитрильные растворы вещества.
7.4 Построение градуировочного графика
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация Фенпропидина в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации Фенпропидина в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:
где S — площадь пика градуировочного раствора.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
|С - С |
к
-------- х 100 <= лямбда , С контр.
где:
С - аттестованное значение массовой концентрации Фенпропидина в
градуировочном растворе; С — результат контрольного измерения массовой концентрации к Фенпропидина в градуировочном растворе; лямбда — норматив контроля градуировочного коэффициента, % контр. (лямбда = 10% при Р = 0,95). контр.
7.5 Подготовка патронов для твердофазной экстракции
Непосредственно перед употреблением через патрон, заполненный силикагелем, пропускают 2,5 куб. см гексана.
Отбор проб зерна производится в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна». Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом зерно и солому измельчают на лабораторных мельницах.
9.1 Определение Фенпропидина в зеленой массе, зерне
и соломе пшеницы
20 г зерна или измельченной зеленой массы или 5 г соломы помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см и экстрагируют 75 куб. см смеси ацетона и воды в соотношении 7:3 в ультразвуковой бане в течение 15 мин. Массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют с тем же объемом экстрагента. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят до 80 куб. см, подкисляют 1 М раствором хлористоводородной кислоты до pH 3,0 и промывают дважды по 25 куб. см гексана. Гексановый экстракт отбрасывают. К отделенному водному слою прибавляют около 5 куб. см 1 М раствора гидроксида натрия до pH 9,0 и экстрагируют фенпропидин трижды по 25 куб. см гексана. Экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2,0 куб. см гексана и вносят в откондиционированный патрон, заполненный силикагелем. Патрон промывают 2 куб. см гексана. Промывку отбрасывают. Фенпропидин элюируют 2 куб. см элюента, приготовленного по п. 7.2.3. Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.
9.2 Условия хроматографирования
Ультраэффективный жидкостной хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (2,1 х 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 +/- 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.
Время удерживания Фенпропидина 4,7 +/- 0,1 мин.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,1 — 1,0 мкг/куб. см.
10. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание Фенпропидина в зеленой массе, зерне и соломе пшеницы (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:
S х К х V 100
х
где:
S - площадь пика Фенпропидина на хроматограмме испытуемого образца,
х
кв. мм (AU); К — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости; V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см; Р — навеска анализируемого образца, г; f — полнота извлечения Фенпропидина, приведенная в табл. 2 (%).
Содержание остаточных количеств Фенпропидина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор Фенпропидина с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
(Х + Х )
1 2
где:
Х и Х - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r - значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ).
r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
(Х +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности Р = 0,95,
Х — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг.
дельта х Х
где дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг <*>.
<*> 0,01 мг/кг — предел обнаружения Фенпропидина в зеленой массе и зерне пшеницы).
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С = ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА , д л,Х л,Х' где +/- ДЕЛЬТА (+/- ДЕЛЬТА ) - характеристика погрешности л,Х л,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания
компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
дельта х Х
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
К = Х' - Х - С , к д где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
______________________
/ 2 2 К = \/ ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА . (1) л,Х' л,Х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 |Х - Х | х 100
1 2
----------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х и Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, г. Санкт-Петербург.
Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации № 01.5.04.2.015.25.11.09 от 26.11.09).