МУК 4.1.2786-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифеноконазола в семенах, масле и зеленой массе рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 24.11.2010)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 24 ноября 2010 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
24 ноября 2010 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИФЕНОКОНАЗОЛА В СЕМЕНАХ, МАСЛЕ И ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ РАПСА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2786-10
с момента утверждения
1. Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом фитопатологии.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 ноября 2010 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Общие положения
Свидетельство об аттестации методики № 0037.16.07.10 от 19.07.2010.
Настоящие Методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств дифеноконазола в семенах рапса в диапазоне 0,02 — 0,2 мг/кг, в зеленой массе и масле рапса в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг.
Название вещества по ИСО: Дифеноконазол.
Название вещества по ИЮПАК: 4-хлорфениловый эфир cis,trans-3-хлор-4-[4-метил-2-(1Н-1,2,4-триазол-1-илметил)-1,3-диоксолан-2-ил]фенила.
Структурная формула (не приводится).
C H Cl N O . 19 17 2 3 3
Кристаллическое вещество от белого до светло-бежевого цвета. -5
Температура плавления: 78,6 °С. Давление паров при 25 °С: 3,3 х 10 мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K log Р = 4,20. Растворимость
ow
(г/куб. дм) при 25 °С: этанол — 330, ацетон — 610, толуол — 490, н-гексан — < 3,4, н-октанол — 95, вода — 0,015.
Вещество устойчиво к гидролизу и фотолизу (при естественном солнечном свете DT = 145 дней).
50
Дифеноконазол быстро сорбируется почвой и медленно разрушается.
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 1453, для мышей — > 50 2000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для кроликов — > 2010 50 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC ) для крыс — > 3300 мг/куб. м 50 воздуха. LC для рыб 0,8 — 1,2 мг/куб. дм (96 ч). Фунгицид нетоксичен для 50 птиц, пчел и дождевых червей.
В России установлены следующие гигиенические нормативы:
ДСД — 0,01 мг/кг массы тела человека; МДУ в свекле сахарной, яблоках и грушах — 0,1 мг/кг, в зерне хлебных злаков — не допускается в пределах чувствительности метода контроля.
Дифеноконазол — системный фунгицид и протравитель семян. Обладает длительным защитным и лечебным действием против широкого круга растительных патогенов из классов аскомицетов, базидиомицетов, дейтеромицетов, включая возбудителей альтернариоза, септориоза, церкоспороза, парши, антракноза, ржавчины, мучнистой росы, а также некоторых патогенов, обитающих на семенах пшеницы, сахарной свеклы, картофеля, семечковых плодовых и овощных культур.
Применяется в России в качестве составного компонента комбинированных протравителей для предпосевной обработки семян сахарной свеклы, зерновых колосовых культур и рапса при норме расхода 45 — 60 г д.в./т семян, а также используется для обработки вегетирующих растений сахарной и столовой свеклы, картофеля, моркови и рапса, яблоневых и грушевых садов с нормой расхода до 100 г д.в./га.
1. Метрологические характеристики
При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, Р = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Зеленая масса | от 0,05 до 0,1 вкл. | 50 | 1,9 | 5 | 6 |
| более 0,1 до 0,5 | 25 | 2,5 | 7 | 8 | |
| Семена | от 0,02 до 0,1 вкл. | 50 | 3,2 | 9 | 11 |
| более 0,1 до 0,2 | 25 | 2,6 | 7 | 9 | |
| Масло | от 0,05 до 0,1 вкл. | 50 | 2,2 | 6 | 7 |
| более 0,1 до 0,5 | 25 | 2,3 | 6 | 8 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20 | ||||
| Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Полнота извлечения вещества, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % | |
| Зеленая масса | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 85,3 | 2,9 | +/- 2,7 |
| Семена | 0,02 | 0,02 — 0,2 | 85,5 | 3,1 | +/- 2,9 |
| Масло | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 84,7 | 2,9 | +/- 2,7 |
2. Метод измерений
Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с электронозахватным детектором (ЭЗД). Контроль дифеноконазола в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из зеленой массы водным ацетоном, из семян водным метанолом и из масла ацетонитрилом, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак-диол.
Идентификация вещества проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
3.1. Средства измерений
Газовый хроматограф "Кристалл 2000М" с ЭЗД номер Госреестра (СКБ "Хроматэк", Россия) N 14516-95
Весы аналитические Sartorius 6110 с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и пределом допустимой погрешности 0,0001 г ГОСТ 24104-2001
Весы лабораторные Meteer P-160 с наибольшим пределом взвешивания до 160 г и пределом допустимой погрешности 0,005 г ГОСТ 24104-2001
Колбы мерные вместимостью 2-100-2; 2-1000-2 ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные 1-1-2-1; 1-1-2-2; 1-2-2-5; 1-2-2-10 ГОСТ 29227-91
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой П-2-5-0,1; П-2-10-0,2 ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные 1-25; 1-50; 1-100; 1-500; 1-1000 ГОСТ 1770-74
3.2. Реактивы
Аналитический стандарт дифеноконазола (CAS 119446-68-3) с содержанием основного вещества 99,5% (Сингента, Швейцария)
Ацетон квалификации чда ГОСТ 2603-79
Ацетонитрил квалификации хч ТУ 6-09-3534-87
Вода дистиллированная или деионизированная ГОСТ 6709-72
н-Гексан квалификации хч ТУ 6-09-3375-78
Калий углекислый квалификации хч ГОСТ 4221-76
Калия перманганат квалификации хч ГОСТ 20490-75
Кислота серная квалификации хч ГОСТ 4204-77
Натрия сульфат безводный квалификации хч ГОСТ 4166-76
Спирт метиловый (метанол) квалификации хч ГОСТ 6995-77
Эфир диэтиловый квалификации хч ТУ 2600-001-45682126-06
3.3. Вспомогательные устройства, материалы
Азот газообразный (баллон) квалификации осч ГОСТ 9293-74
Аппарат для встряхивания проб АВУ-1 ТУ 64-1-1081-73
Ванна ультразвуковая, модель D-50, фирма Branson Instr. Co. (США)
Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная ГОСТ 5556-81
Гомогенизатор «Omni-mixer» (Sorvall, США) или гомогенизатор МРТУ 42-1505
Дистиллятор Cyclon III, мод. 4 BD (Fistreem, Великобритания)
Установка Elgastat B 114 с патроном Elgacan B 114 для получения деионизированной воды (Elga, Великобритания)
Воронки делительные вместимостью 100 куб. см ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные стеклянные ГОСТ 25336-82
Колбы плоскодонные вместимостью 250 куб. см ГОСТ 9737-93
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 25 и 100 куб. см ГОСТ 9737-93
Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая ZB-1 (типа SE-30), длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, фирма Phenomenex (США), или аналогичная
Колонка хроматографическая стеклянная длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм
Мельница лабораторная электрическая ТУ 46-22-236-84
Патроны концентрирующие Диапак-диол (0,6 г) /ЗАО «БиоХимМак СТ», Москва/ ТУ 4215-001-05451931-94
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi (Швейцария) ТУ 25-11-917-76
Силикагель (60 — 80 меш) для адсорбционной хроматографии (Вельм, Германия) I степени активности
Стаканы химические вместимостью 100 и 500 куб. см ГОСТ 25336-82
Установка для перегонки растворителей с ГОСТ 9737-93
дефлегматором (ИСО 641-75) Фильтры бумажные "красная лента" обеззоленные ТУ 6-09-2678-77
Шприц медицинский с разъемом Льюера вместимостью 20 куб. см ГОСТ 22090.
Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже приведенных в разделе 3.
4. Требования безопасности
4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88.
4.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.
4.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.
4.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.
6. Условия выполнения измерений
6.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия.
Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:
- температура воздуха (20 +/- 5) °С;
- атмосферное давление (84 — 106) кПа;
- относительная влажность воздуха не более 80%.
6.2 Условия хроматографического анализа
Температура термостата испарителя 275 °С;
Режим программирования температуры колонки:
начальная температура 200 °С (2 мин.), скорость подъема температуры до 270 °С (0 мин.) 20 °С/мин.;
от 270 до 280 °С (10 мин.), скорость подъема температуры 5 °С/мин.
газа-носителя (азот) 2,5 куб. см/мин.;
поддувочного газа через детектор 25 куб. см/мин.
Объем вводимой пробы: 1 куб. мм.
Время удерживания дифеноконазола: 8 мин. 20 с +/- 2%.
Линейный диапазон детектирования: (0,02 — 0,4) нг.
7. Подготовка к выполнению измерений
Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующих патронов Диапак-диол.
7.1. Очистка органических растворителей
7.1.1 Очистка н-гексана
Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.
7.1.2 Очистка ацетона
Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г KMnO и 2 г K CO ). 4 2 3
7.1.3 Очистка силикагеля
Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объема ацетона, высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 5 — 6 часов и затем активируют при температуре 130 °С в течение 5 часов.
7.2. Подготовка и кондиционирование хроматографической колонки
Капиллярную кварцевую колонку ZB-1 (типа SE-30) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280 °С и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 — 10 часов.
7.3. Подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона Диапак-диол для очистки экстракта
Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 — 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию: 3 г силикагеля I степени активности в 15 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают последовательно с помощью медицинского шприца 10 куб. см ацетона и 6 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2, по объему) со скоростью 5 куб. см/мин.
7.4. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из колонки с силикагелем
При отработке методики или поступлении новой партии силикагеля проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из колонки с силикагелем.
В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора № 1 дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см в смеси гексан — ацетон (8:2, по объему) (п. 7.6.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.3. Промывают колонку 30 куб. см смеси гексан — ацетон (7:3, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 40 куб. см смеси гексан — ацетон (1:1, по объему), отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С, сухие остатки растворяют в 1 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и затем хроматографируют в соответствии с п. 6.2.
По результатам обнаружения дифеноконазола в каждой фракции определяют объем смеси гексан — ацетон (1:1, по объему), необходимый для полного вымывания фунгицида с колонки.
7.5. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из патрона Диапак-диол
В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора № 1 дифеноконазола с концентрацией 2 мкг/куб. см в смеси гексан — ацетон (8:2, по объему) (п. 7.6.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 1 куб. см смеси гексан — ацетон (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на патрон Диапак-диол, подготовленный по п. 7.3. Промывают патрон 2 куб. см смеси гексан — ацетон (9:1, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через патрон пропускают 20 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2, по объему), отбирая последовательно по 5 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С, сухие остатки растворяют в 1 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и затем хроматографируют в соответствии с п. 6.2.
По результатам обнаружения дифеноконазола в каждой фракции определяют объем смеси гексан — ацетон (8:2, по объему), необходимый для полного вымывания фунгицида из патрона.
7.6. Приготовление градуировочных растворов
7.6.1 Исходный раствор дифеноконазола для градуировки с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г дифеноконазола, растворяют в 40 — 50 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2, по объему), доводят объем раствора этой же смесью до метки, тщательно перемешивают.
Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °С в течение 3-х месяцев.
7.6.2 Градуировочный раствор дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см (раствор № 1)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 2 куб. см исходного раствора дифеноконазола с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.6.1), разбавляют смесью гексан — ацетон (8:2, по объему) до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов № 2 — 5.
Градуировочный раствор № 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °С в течение месяца.
7.6.3. Градуировочные растворы дифеноконазола с массовой концентрацией (0,02 — 0,2) мкг/куб. см (растворы № 2 — 5)
В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора № 1 дифеноконазола с массовой концентрацией 2 мкг/куб. см (п. 7.6.2), доводят до метки смесью гексан — ацетон (8:2, по объему), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией дифеноконазола 0,02; 0,04; 0,1 и 0,2 мкг/куб. см соответственно.
Растворы готовят непосредственно перед использованием.
7.7. Градуировка хроматографа
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ х с) от концентрации дифеноконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м градуировочным растворам (п. 7.6.3).
В испаритель (инжектор) хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.6.3) и анализируют при условиях п. 6.2. Каждый раствор хроматографируют дважды. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r.
7.8. Контроль стабильности градуировочной характеристики
Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.
Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.
Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:
S - S
изм гр
---------- х 100 <= К ,
S гр
гр
где:
S и S - значение площади пика дифеноконазола в образце для
изм гр
контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике
соответственно, усл. ед.;
К - норматив контроля, К = 0,5 ДЕЛЬТА, где:
гр гр
+/- дельта — границы относительной погрешности, % (табл. 1).
Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.
Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.
8. Отбор, подготовка и хранение проб
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.1979) и правилами, определенными ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб» и ГОСТ 8988-2002 «Масло рапсовое. Технические условия».
Пробы зеленой массы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре (-18) °С до анализа. Пробы семян высушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу. Пробы масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °С.
9. Выполнение определения
9.1. Экстракция дифеноконазола
9.1.1. Зеленая масса. Образец измельченного растительного материала массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон — вода (8:2, по объему) и гомогенизируют 3 мин. при 10000 об./мин. Раствор (с осадком) фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см смеси ацетон — вода (8:2, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/10 объема экстракта (эквивалентную 2 г образца), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и добавляют 20 куб. см дистиллированной воды. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.
9.1.2. Семена. Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 70 куб. см смеси метанол — вода (8:2, по объему) и помещают на аппарат для встряхивания на 40 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 30 куб. см смеси метанол — вода (8:2, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, куда приливают 20 куб. см гексана. Воронку встряхивают в течение 1 мин. и после разделения фаз гексановую фракцию отбрасывают, а водно-метанольную фракцию переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.
9.1.3. Масло. К образцу масла массой 5 г, помещенного в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 50 куб. см ацетонитрила, перемешивают и колбу помещают на встряхиватель на 40 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют в химический стакан через слой ваты, помещенной в конусную воронку. К оставшемуся в колбе маслу приливают 25 куб. см ацетонитрила и операцию экстракции повторяют. После декантации ацетонитрильного слоя вату промывают 10 куб. см ацетонитрила. Измеряют объем объединенного ацетонитрильного экстракта и 2/5 его части (эквивалентные 2 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, куда приливают 15 куб. см гексана. Воронку встряхивают в течение 1 мин. и после разделения фаз ацетонитрильную фракцию переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.3.
9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Экстракты, полученные по пп. 9.1.1 и 9.1.2 и помещенные в круглодонные колбы, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (5 — 10 куб. см) при температуре не выше 40 °С. К водному остатку прибавляют 20 куб. см дистиллированной воды, содержимое перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 30 куб. см смеси гексан — диэтиловый эфир (4:1, по объему), интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 25 куб. см смеси гексан — диэтиловый эфир (4:1, по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С и подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем по п. 9.3.
9.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем
Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по пп. 9.1.3 и 9.2, растворяют в 0,6 куб. см ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,4 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 2 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 20 куб. см смеси гексан — ацетон (7:3, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют с колонки 25 куб. см смеси гексан — ацетон (1:1, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток экстрактов зеленой массы и семян растворяют в 5 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 10. Экстракт масла дополнительно очищают с помощью концентрирующего патрона Диапак-диол.
9.4. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак-диол
Сухой остаток экстракта масла в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют с помощью ультразвуковой ванны в 2 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2, по объему) и переносят в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 7.2). Патрон промывают 2,5 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2, по объему), элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют 9 куб. см смеси гексан — ацетон (7:3, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 25 куб. см. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 30 °С. Остаток в колбе растворяют в 5 куб. см смеси гексан — ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 10.
10. Выполнение измерений
10.1. В инжектор хроматографа вводят 1 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (п. п. 9.1 - 9.4), анализируют при условиях (п. 6.2) и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.
10.2. Для каждого образца зеленой массы, семян и масла повторяют операции по п. п. 9.1 - 9.4, 10.1.
11. Обработка результатов измерений
Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации «Хроматэк Аналитик», версия 1.20.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание дифеноконазола рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
Н х А х V
1
Х = ------------ х Р, 100 х Н х m 0
где:
Х - содержание дифеноконазола в пробе, мг/кг;
Н - площадь пика образца, мВ х с;
1
Н - площадь пика стандарта, мВ х с;
0
А - концентрация стандартного раствора дифеноконазола, мкг/куб. см;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с силикагелем и патроне и
последующего хроматографического определения, г. Р — содержание дифеноконазола в аналитическом стандарте, %.
12. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
13. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(Х +/- ДЕЛЬТА), мг/кг (куб. дм), при вероятности Р = 0,95,
где:
_
Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг (куб. дм);
ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг (куб. дм);
дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“»
менее 0,02 мг/кг для семян рапса <*>;
менее 0,05 мг/кг для зеленой массы и масла рапса <**>.
<*> 0,02 мг/кг — предел обнаружения для семян.
<**> 0,05 мг/кг — предел обнаружения для зеленой массы и масла.
Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал дифеноконазола, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,2 мкг/куб. см, разбавляют, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой. При расчете содержания дифеноконазола учитывают разбавление.
14. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
14.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
14.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,Х л,Х' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,Х л,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг (куб. дм), при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг (куб. дм);
дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
_ _ К = Х' - Х - С , к д _ _ где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 12) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг (куб. дм).
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,Х' л,Х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
14.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг (куб.
1 2
дм); R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
(n = 5)
| Матрица | Внесено дифеноконазола, мг/кг | Открыто дифеноконазола, % | Доверительный интервал среднего результата, % |
| Зеленая масса | 0,05 | 83,4 | +/- 3,7 |
| 0,10 | 84,6 | +/- 2,5 | |
| 0,25 | 85,6 | +/- 2,3 | |
| 0,50 | 87,6 | +/- 2,1 | |
| Семена | 0,02 | 84,0 | +/- 3,7 |
| 0,04 | 84,4 | +/- 3,0 | |
| 0,10 | 85,4 | +/- 2,5 | |
| 0,20 | 88,2 | +/- 2,2 | |
| Масло | 0,05 | 82,8 | +/- 2,7 |
| 0,10 | 83,6 | +/- 2,5 | |
| 0,25 | 85,4 | +/- 2,2 | |
| 0,50 | 87,0 | +/- 2,3 |