МУК 4.1.2783-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств метрафенона в воде, почве, зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур, ягодах и соке винограда методом ВЭЖХ. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 24.11.2010)
Примечание
Документ введен в действие с 24 ноября 2010 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
24 ноября 2010 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ МЕТРАФЕНОНА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР, ЯГОДАХ И СОКЕ ВИНОГРАДА МЕТОДОМ ВЭЖХ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2783-10
с момента утверждения
1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 ноября 2010 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Общие положения
Свидетельство об аттестации методики № 01.5.04.683 от 25.06.2010.
Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств метрафенона в воде в диапазоне концентраций 0,001 — 0,01 мг/кг, в почве, зеленой массе и зерне зерновых культур, ягодах и соке винограда в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг, в соломе зерновых культур 0,02 — 0,2 мг/кг.
Действующее вещество: метрафенон.
Структурная формула (не приводится).
3'-Бром-2,3,4,6'-тетраметокси-2',6-диметилбензофенон (IUPAC).
Брутто-формула: C H BrO . 19 21 5
Химически чистое вещество представляет собой белый кристаллический порошок.
Температура плавления 99,2 — 100,8 °С.
Давление пара 0,153 мРа (20 °С); 0,256 мРа (25 °С).
Коэффициент распределения в системе н-октанол — вода K log P = 4,3 ow (pH 4,0, 25 °С).
Растворимость в воде (мг/куб. дм, 20 °С): 0,552 (pH 5); 0,492 (pH 7); 0,457 (pH 9).
Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °С): ацетон — 403, ацетонитрил — 165, дихлорметан — 1950, этилацетат — 261, н-гексан — 4,8, метанол — 26,1, толуол — 363.
Устойчив к водному гидролизу в темноте после выдержки при 50 °С в течение 5 дней в буферных растворах при pH 4,0; 7,0 и 9,0. Заметно разлагается после облучения солнечным светом в течение 15 дней при 22 °С и pH 7,0. DT составляет 3,1 дня.
50
Краткая токсикологическая характеристика: острая оральная токсичность для крыс - LD > 5000 мг/кг; дермальная для крыс - LD > 5000 мг/кг 50 50 (подкожно); ингаляционная для крыс - LC > 5,0 мг/л. Не является
50
ирритантом и не обладает кожным раздражающим действием.
Область применения: фунгицид превентивного действия с антиспорулянтной активностью и целебными свойствами. Используется для контроля глазковой пятнистости, вызываемой Pseudocercosporella herpotrichoides, и ложной мучнистой росы, вызываемой Erysiphe graminis, на посевах ячменя, озимой и яровой пшеницы.
В России для метрафенона гигиенические нормативы не установлены.
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Объект анализа | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/куб. дм) | Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), сигма , % r | Показатель внутрилабораторной прецизионности, сигма , % R л | Показатель воспроизводимости, сигма , % R | Показатель точности <*> (границы относительной погрешности), +/- дельта, % |
| Вода | 0,001 — 0,005 0,005 — 0,01 | 9 6 | 11,9 7,9 | 15 10 | 29 20 |
| Почва | 0,01 — 0,05 0,05 — 0,1 | 5 5 | 8,2 6,9 | 10 9 | 20 18 |
| Ягоды винограда | 0,01 — 0,05 0,05 — 0,1 | 5 3 | 7,1 3,9 | 9 5 | 18 10 |
| Сок винограда | 0,01 — 0,05 0,05 — 0,1 | 4 4 | 5,5 5,6 | 8 8 | 18 18 |
| Зерно пшеницы или ячменя | 0,01 — 0,05 0,05 — 0,1 | 5 4 | 6,7 5,1 | 9 7 | 18 14 |
| Зеленая масса пшеницы или ячменя | 0,01 — 0,05 0,05 — 0,1 | 5 4 | 6,6 5,3 | 9 7 | 18 14 |
| Солома пшеницы или ячменя | 0,02 — 0,1 0,1 — 0,2 | 4 2 | 5,1 2,5 | 7 4 | 14 8 |
| <*> Соответствует расширенной неопределенности U . При отн коэффициенте охвата k = 2. | |||||
ДЛЯ n = 20, P = 0,95
| Анализируемый объект | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Вода | 0,001 | 0,001 — 0,01 | 96,1 | 5,5 | 2,6 |
| Почва | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 93,9 | 6,1 | 2,9 |
| Ягоды винограда | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 96,9 | 5,5 | 2,6 |
| Сок винограда | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 91,9 | 5,2 | 2,5 |
| Зерно пшеницы или ячменя | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 94,9 | 3,8 | 0,9 |
| Зеленая масса пшеницы или ячменя | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 88,9 | 13,7 | 6,4 |
| Солома пшеницы или ячменя | 0,02 | 0,02 — 0,2 | 93,2 | 8,6 | 4,05 |
2. Метод измерения
Методика основана на определении метрафенона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов смесью органического растворителя с водой и очистки экстракта посредством двухстадийной твердофазной экстракции на патронах, заполненных гексадецилсиликагелем и обычным силикагелем.
Идентификация метрафенона проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы
3.1. Средства измерений
Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ-детектором, снабженным дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-2001
Весы технические ВЛКТ-500 ГОСТ 24104-2001
Колбы мерные на 10, 50, 100 и 1000 куб. см ГОСТ 23932-90
Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см
Пипетки градуированные ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные на 50 и 100 куб. см ГОСТ 23932-90.
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ", или хч ТУ 6-09-3534-87 Гексан, хч ТУ 2631-003-05807999-98
Вода бидистиллированная деионизированная ГОСТ 6709-79
Метрафенон с содержанием основного вещества 99,7% (Reg. № 4037710, BAS 560 F)
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и воды в соотношении 65:35.
Допускается использование реактивов квалификации не ниже указанной.
3.3. Вспомогательные устройства и материалы
Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters)
Воронки лабораторные В-75-110 ГОСТ 25336-82
Ротационный вакуумный испаритель фирмы BUCHI, мод. R 205
Фильтры бумажные «красная лента» ТУ 6.091678-86
Патроны Диапак С16 (Биохиммак) 0,4 г
Патроны, заполненные силикагелем, 60 (Merck) 0,5 г.
Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.
4. Требования безопасности
4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны».
5. Требования к квалификации операторов
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
6. Условия измерений
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к определению
7.1. Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку (Acquity ВЕН С18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.
7.2. Приготовление растворов
7.2.1. Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм помещают 650 куб. см ацетонитрила и доводят объем до метки водой для ВЭЖХ.
7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов
7.3.1. Основной раствор с концентрацией 1,0 мг/куб. см: точную навеску метрафенона (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.
Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.
7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,1 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией 0,8 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят 8,0 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,4 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 4,0 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2,0 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1,0 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 1 недели, градуировочные растворы — в течение суток.
7.4. Приготовление элюентов для твердофазной экстракции
7.4.1. Приготовление элюента 1: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 50 куб. см гексана и доводят объем до метки ацетоном.
7.5. Построение градуировочного графика
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика -концентрация метрафенона в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации метрафенона в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:
где S — площадь пика градуировочного раствора.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
|C - C |
к
-------- х 100 <= лямбда , C контр.
где:
C - аттестованное значение массовой концентрации метрафенона в
градуировочном растворе; C — результат контрольного измерения массовой концентрации метрафенона к в градуировочном растворе; лямбда — норматив контроля градуировочного коэффициента, % контр. (лямбда = 10% при P = 0,95). контр.
7.6. Подготовка патронов для твердофазной экстракции
7.6.1. Подготовка патронов Диапак С16. Непосредственно перед употреблением через патрон последовательно пропускают по 2 куб. см ацетонитрила и воды.
7.6.2. Подготовка патронов, заполненных силикагелем. Непосредственно перед употреблением через патрон последовательно пропускают 2,5 куб. см гексана.
8. Отбор проб и хранение
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.1979).
Пробы ягод винограда хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Пробы сока хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 3 суток, при температуре -18 °С — в течение месяца (в пластиковых бутылях).
Для длительного хранения пробы почвы, зерна и соломы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Пробы зерна и соломы подсушивают до критической влажности и хранят в воздушно-сухом состоянии. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, пробы зерна и соломы измельчают на лабораторной мельнице.
9. Проведение определения
9.1. Определение метрафенона в воде
50 куб. см воды пропускают через патрон Диапак С16. Фильтрат отбрасывают. Метрафенон элюируют 3 куб. см ацетона. Элюат выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 0,5 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.
9.2. Определение метрафенона в почве и ягодах винограда
20 г образца помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см и экстрагируют 50 куб. см смеси ацетона с водой в соотношении 4:1 в ультразвуковой бане в течение 15 мин. Массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют дважды с тем же объемом экстрагента. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Водный остаток пропускают через два патрона Диапак С16, соединенных последовательно. Фильтрат отбрасывают. Патрон промывают 2 куб. см воды. Фильтрат отбрасывают. Метрафенон элюируют 3 куб. см ацетона. Элюат упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2,0 куб. см гексана и вносят в патрон с силикагелем. Фильтрат отбрасывают. Патрон промывают 2 куб. см гексана. Фильтрат отбрасывают. Метрафенон элюируют 2 куб. см элюента 1. Элюат упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.
9.3. Определение метрафенона в виноградном соке
Сок фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр «красная лента». 20 куб. см сока пропускают через патрон Диапак С16. Фильтрат отбрасывают. Патрон промывают 2 куб. см воды. Фильтрат отбрасывают. Метрафенон элюируют 3 куб. см ацетона. Далее определение проводят по п. 9.2.
9.4. Определение метрафенона в зерне, зеленой массе и соломе зерновых культур
20 г зерна или измельченной зеленой массы или 5 г соломы помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см и экстрагируют 50 куб. см смеси ацетона и воды в соотношении 4:1 в ультразвуковой бане в течение 15 мин. Массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют дважды с тем же объемом экстрагента. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Водный остаток пропускают через 2 патрона Диапак С16, соединенных последовательно. Фильтрат отбрасывают. Патроны промывают 2 куб. см воды. Фильтрат отбрасывают. Метрафенон элюируют 4 куб. см ацетонитрила. Элюат выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2,0 куб. см гексана и вносят в патрон с силикагелем. Фильтрат отбрасывают. Дальнейшее определение проводят по п. 9.2. Перед хроматографическим анализом сухой остаток образцов зерна и зеленой массы растворяют в 2 куб. см, а соломы — в 1 куб. см подвижной фазы. По 10 куб. мм полученных растворов вводят в хроматограф.
9.5. Условия хроматографирования
Ультраэффективный жидкостной хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (2,1 х 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 +/- 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и воды в соотношении 65:35. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.
Время удерживания метрафенона (5,5 +/- 0,3) мин.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,1 — 1,0 мкг/куб. см.
10. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание метрафенона в воде, почве, зеленой массе зерне и соломе зерновых культур, ягодах и соке винограда (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
S х K х V 100
x
X = ---------- х ---, P f где: S — площадь пика метрафенона на хроматограмме испытуемого образца, кв. x мм (AU); K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости; V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см; P — навеска анализируемого образца, г; f — полнота извлечения метрафенона, приведенная в табл. 2, %.
Содержание остаточных количеств метрафенона в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор метрафенона с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 |X - X | х 100
1 2
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r - значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ).
r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
(X +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности Р = 0,95,
где:
X - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
дельта х X
дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг <*>).
<*> 0,01 мг/кг — предел обнаружения метрафенона в почве, соке и ягодах винограда, зерне и зеленой массе зерновых культур.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С = ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА , д л,Х л,Х' где +/- ДЕЛЬТА (+/- ДЕЛЬТА ) - характеристика погрешности л,Х л,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
дельта х X
дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
К = X' - X - С , к д где X', X, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
______________________
/ 2 2 К = / ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА . (1) \/ л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 |X - X | х 100
1 2
----------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.