МУК 4.1.2782-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств карбендазима в зерне гороха и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 24.11.2010)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 24 ноября 2010 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
24 ноября 2010 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КАРБЕНДАЗИМА В ЗЕРНЕ ГОРОХА И МАСЛЕ РАПСА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2782-10
с момента утверждения
1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 ноября 2010 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Свидетельство об аттестации методики № 01.5.04.673 от 25.06.2010.
Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств карбендазима в зерне гороха и масле рапса в диапазоне концентраций 0,05 — 0,5 мг/кг.
Действующее вещество: карбендазим.
Структурная формула (не приводится).
Метилбензимидазол-2-илкарбамат (IUPAC).
Брутто-формула: C H № O . 9 9 3 2
Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок без цвета и запаха.
Температура плавления 302 — 307 °С (с разложением).
Давление пара 0,09 мРа (20 °С); 0,15 мРа (25 °С); 1,3 мРа (50 °С).
Коэффициент распределения в системе н-октанол — вода K lg P = 1,38 ow (pH 5); 1,51 (pH 7); 1,49 (pH 9).
Растворимость в воде (мг/куб. дм, 24 °С): 29 (pH 4); 8 (pH 7); 7 (pH 8).
Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 24 °С): диметилформамид — 5; ацетон — 0,3; этанол — 0,3; хлороформ — 0,1; этилацетат — 0,135; дихлорметан — 0,068; бензол — 0,036; циклогексан и диэтиловый эфир — < 0,01; н-гексан — 0,0005.
Субстанция карбендазима стабильна по крайней мере в течение 2 лет при температуре хранения ниже 50 °С, а также после 7 дней интенсивного облучения светом (20000 люкс). В щелочных растворах медленно разлагается. При 22 °С DT превышает 350 дней (pH 5 и 7) и равен 124 дням (pH 9).
50
Будучи слабым основанием (рК 4,2), в кислых растворах образует стабильные а водорастворимые соли.
Краткая токсикологическая характеристика: острая оральная токсичность -
LD для крыс - 6400 мг/кг; для собак - более 2500 мг/кг; дермальная - LD 50 50 для кроликов более 10000 мг/кг; для крыс - более 2000 мг/кг; не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз; ингаляционная - при использовании водной суспензии 10 г/л эффект не обнаружен для крыс,
кроликов, морских свинок и кошек. Период наблюдения 4 часа.
Область применения: фунгицид системного действия с длительным защитным и целебным эффектом. Эффективно подавляет развитие заболеваний растений, вызываемых грибами из родов Septoria, Fusarium, Erysiphe и Pseudocercosprella на зерновых культурах; Sclerotinia, Alternaria и Cylindrosporium на семенах рапса.
В России для карбендазима установлены следующие гигиенические нормативы:
- ПДК в воде — 0,1 мг/куб. дм;
- ОДК в почве — 0,1 мг/кг;
- МДУ (мг/кг) — корнеплоды сахарной свеклы 0,1; зерно хлебных злаков 0,2.
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Объект анализа | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Норматив точности (границы относительной погрешности), +/- дельта, % | Относительное стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Зерно гороха | 0,05 — 0,1 0,1 — 0,5 | <= 50 <= 25 | 6,9 3,6 | 19 10 | 36 30 |
| Масло рапса | 0,05 — 0,1 0,1 — 0,5 | <= 50 <= 25 | 3,9 3,4 | 11 9 | 28 20 |
СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА ДЛЯ n = 20, P = 0,95
| Объект анализа | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S | Доверительный интервал среднего результата, +/- % |
|---|---|---|---|---|---|
| Зерно гороха | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 85,9 | 10,3 | 20 |
| Масло рапса | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 95,7 | 9,2 | 18 |
Методика основана на определении карбендазима методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем и очистки экстракта путем перераспределения кислотно-основных форм карбендазима между двумя несмешивающимися фазами.
Идентификация карбендазима проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
вспомогательные устройства и материалы
3.1 Средства измерений
Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-2001
Весы технические ВЛКТ-500 ГОСТ 24104-80
pH-метр фирмы Hanna Instrument, мод. Р212
Колбы мерные на 10, 50, 100, 1000 куб. см ГОСТ 23932-90
Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см
Пипетки градуированные ГОСТ 29227-91
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ», или хч ТУ 6-09-3534-87
Вода бидистиллированная деионизированная ГОСТ 6709-79
Гексан, хч ТУ 2631-003-05807999-98
Гидроксид натрия, 1 М водный раствор
Карбендазим с содержанием основного вещества 99,4%
Натрий сернокислый безводный, хч ГОСТ 4166-76
Соляная кислота, 0,1 М водный раствор
Трифторуксусная кислота, ч, 0,05%-ный водный раствор ТУ 6-09-3877-80
Этилацетат ГОСТ 223000-76
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,05%-ной трифторуксусной кислоты в соотношении 10:90.
Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH
С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters)
Воронки лабораторные В-75-110 ГОСТ 25336-82
Ротационный вакуумный испаритель фирмы BUCHI, мод. R 205
Ультразвуковая баня УЗВ-1,3 ГОСТ Р МЭК 60335-2-15-98 Фильтры бумажные "красная лента" ТУ 6.091678-86.
Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.
4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны».
5. Требования к квалификации операторов
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7.1 Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку (Acquity BEH С18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.
7.2 Приготовление растворов
7.2.1. 0,05%-ный раствор трифторуксусной кислоты: 0,5 куб. см свежеперегнанной трифторуксусной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.
7.2.2. Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм помещают 100 куб. см ацетонитрила и доводят объем до метки 0,05%-ным раствором трифторуксусной кислоты.
7.3 Приготовление основного и градуировочных растворов
7.3.1. Основной раствор с концентрацией 1,0 мг/куб. см: точную навеску карбендазима (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.
Градуировочные растворы с концентрациями 0,4; 0,8; 1,2; 2,0 и 4,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.
7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией 4,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,4 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией 2,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,2 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией 1,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 3 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,8 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2,0 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,4 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1 куб. см раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.
При изучении полноты определения карбендазима в зерне гороха и масле рапса используют ацетонитрильные растворы вещества.
7.4.1 Построение градуировочного графика
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация карбендазима в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбендазима в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:
где S — площадь пика градуировочного раствора.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
|С - С |
к
-------- х 100 <= лямбда , С контр.
где:
С - аттестованное значение массовой концентрации карбендазима в
градуировочном растворе; С — результат контрольного измерения массовой концентрации к карбендазима в градуировочном растворе; лямбда — норматив контроля градуировочного коэффициента, % контр. (лямбда = 10% при P = 0,95). контр.
Отбор проб зерна гороха проводят в соответствии с ГОСТ 28674-90 «Горох. Требования по заготовке и поставке».
Среднюю пробу зерна гороха измельчают, перемешивают и выделяют аналитические пробы. Для длительного хранения аналитические пробы зерна гороха помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.
Отбор проб семян рапса для получения масла проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.
9.1 Определение карбендазима в зерне гороха
10 г измельченных семян гороха помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 5 куб. см воды и 50 куб. см этилацетата. Экстрагируют в ультразвуковой бане в течение 10 мин. Массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр «красная лента» и экстракцию повторяют с 50 куб. см этилацетата. Объединенный экстракт помещают в делительную воронку и отделившийся водный слой отбрасывают. Из органического экстракта карбендазим экстрагируют 30 куб. см 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной. Водный слой отделяют. Экстракцию повторяют еще 2 раза. Объединенный водный экстракт промывают последовательно дважды по 30 куб. см гексана и дважды по 20 куб. см этилацетата <*>. Органические слои отбрасывают, а водный подщелачивают 1 М раствором гидроксида натрия до pH 10 и экстрагируют карбендазим 30 куб. см этилацетата. Экстракцию повторяют еще дважды, доводя pH водной фазы до 10 перед каждой экстракцией. Этилацетатный экстракт помещают в делительную воронку, выделившийся водный (нижний) слой отбрасывают, а органический промывают 25 куб. см воды, доведенной до pH 10 1 М раствором гидроксида натрия. Промывку отбрасывают. Органический экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1,25 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.
<*> Повторную экстракцию нужно проводить только после полного разделения фаз. Для ускорения процесса разделения можно в делительную воронку добавить 1 — 2 куб. см этилового спирта.
9.2 Определение карбендазима в масле рапса
10 г масла растворяют в 90 куб. см гексана, помещают в делительную воронку вместимостью 250 куб. см и экстрагируют 30 куб. см 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной. Экстракцию повторяют еще два раза. Гексан отбрасывают. Объединенный водный экстракт промывают последовательно дважды по 30 куб. см гексана и дважды по 20 куб. см этилацетата. Органические слои отбрасывают, а водный подщелачивают 1 М раствором гидроксида натрия до pH 10 и экстрагируют карбендазим 30 куб. см этилацетата. Экстракцию повторяют еще дважды, доводя pH водной фазы до 10 перед каждой экстракцией. Объединенный этилацетатный экстракт промывают 25 куб. см, доведенной до pH 10 1 М раствором гидроксида натрия. Промывку отбрасывают, а органический экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1,25 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.
9.3 Условия хроматографирования
Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH С18 (2,1 х 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 +/- 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,05%-ной трифторуксусной кислоты в соотношении 10:90. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 280 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,4 — 4,0 мкг/куб. см.
10. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание карбендазима в зерне гороха или масле рапса (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
S х К х V 100
x
P f
где:
S - площадь пика карбендазима на хроматограмме испытуемого образца,
x
кв. мм (AU); К — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости; V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см; P — навеска анализируемого образца, г; f — полнота извлечения карбендазима, приведенная в табл. 2, %.
Содержание остаточных количеств карбендазима в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбендазима с концентрацией 4,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |X - X | х 100
1 2
1 2
где:
X и X - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r - значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ).
r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
(X +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности P = 0,95,
X — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
дельта х X
где ДЕЛЬТА — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,05 мг/кг <*>).
<*> 0,05 мг/кг — предел обнаружения карбендазима в зерне гороха и масле рапса.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
д
С = ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА , д л,X л,X' где +/- ДЕЛЬТА (+/- ДЕЛЬТА ) - характеристика погрешности л,X л,X' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
дельта х X
где ДЕЛЬТА - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
К = X' - X - С , к д где X', X, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
______________________
/ 2 2 К = \/ ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА . (1) л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 |X - X | х 100
1 2
----------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
где:
X и X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.